Chuyển nạp và biểu hiện DNA ngoại lai trong tế bào eukaryote nuôi cấy in vitro được bắt đầu cách đây hơn 30 năm. Chuyễn nhiễm (transfection) đã mở đầu cho một chuỗi da dạng và phức tạp của các kỹ thuật chuyển nạp gen. Hầu như đồng thời với sự phát triển các quy trình chuyển nạp gen là việc khám phá ra enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) từ đó có thể tạo ra các bản sao DNA bổ sung (cDNA) của mọi mRNA. Sự phát hiện enzyme cắt hạn chế đã mở ra kỹ nguyên của công nghệ DNA tái tổ hợp. Nhìn chung, việc phát triển các phương thức thao tác DNA để tạo ra công nghệ di truyền thực vật, động vật và liệu pháp gen ở người đã trở thành hiện thực. Các kỹ thuật hiện đại đã cải thiện hiệu quả chuyển DNA, tăng sự đa dạng của vector để điều hòa và tạo thuận lợi cho biểu hiện của gen trong một phạm vi rộng các loại tế bào đích (target cell).
Chuyển gen được định nghĩa như là việc đưa DNA bên ngoài vào genome, sao cho nó ổn định và duy trì cùng với di truyền của vật chủ. Hơn 15 năm qua, việc đưa chuyển gen vào genome của động vật có vú đã trở thành một công cụ thực nghiệm thường làm đều đặn và đang tăng tầm quan trọng trong công nghiệp công nghệ sinh học. Thông thường, DNA ngoại lai được đưa vào trong một phôi một tế bào bằng phương pháp vi tiêm và các phôi sống sót và sau đó được cấy vào con cái thụ tinh giả và cho phép phát triển tới kỳ hạn. Trong một phần của các phôi, được cung cấp rằng DNA đã hợp nhất trong genome trước khi phân chia tế bào lần thứ nhất, thể chuyển gen sẽ được chuyển qua những lần sinh sản tiếp theo thông qua mầm con.
Các kỹ thuật chuyển gen có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu. Ở mức độ phân tử chúng cho phép xác nhận các trình tự cis-acting DNA quan trọng trong sự biểu hiện gen đặc trưng mô và/hoặc phát triển định hướng, và thao tác đặc biệt của sự biểu hiện gen in vivo. Với sự ra đời của kỹ thuật tế bào mầm phôi (embryo stem-ES), và sự phát triển các phương thức để đạt được sự tái tổ hợp tương đồng, các nghiên cứu hiện nay có khả năng tìm hiểu về chức năng của một gen đặc biệt và xác định chắc chắn các ảnh hưởng in vitro của những biến đổi đặc biệt đến chức năng gen. Sự đổi mới này có nhiều gợi ý quan trọng cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh- y bao gồm thiết các mô hình bệnh, sử dụng mẹ như là các hệ lên men cho việc sản xuất các protein trị liệu ở người và, cuối cùng, sửa chữa những sai sót bẩm sinh của sự chuyển hóa bởi gen đích.
1. Các phương pháp chuyển nạp gen
Có nhiều phương pháp thích hợp để chuyển DNA ngoại lai vào trong các tế bào eukaryote, chẳng hạn như: chuyển nhiễm (hóa biến nạp) bằng calcium phostphate hoặc diethylaminoethyl-dextran (DEAE-dextran), xung điện, lipofection, liposome, virus vector (kể cả các tiểu phần phage), vi tiêm và bắn gen (vi đạn)…
Chọn phương pháp chuyển gen phụ thuộc vào mức độ biểu hiện được mong đợi, biểu hiện trong thời gian ngắn hoặc biểu hiện ổn định; loại tế bào đích, như tế bào dịch huyền phù hoặc tế bào dịch bám, các dòng tế bào đã thích nghi hoặc phân hóa. Mỗi phương pháp đều đòi hỏi sự tối ưu cao, bao gồm các yếu tố như: số lượng tế bào, nồng độ DNA, các vector biểu hiện. Tổng quan tóm tắt một số phương pháp chuyển nạp gen thông dụng dưới đây để mô tả kỹ thuật cơ bản, hiệu quả biểu hiện gen, và các cải tiến gần đây minh họa cho các ứng dụng lâm sàng.
1.1. Phương pháp chuyển nhiễm (transfection)
Dùng calcium phostphate kết tủa DNA, có phạm vi hiệu quả từ 1-104 khuẩn lạc/106 tế bào/μg DNA. Sự hợp nhất của DNA ngoại lai trong DNA tế bào mang tính ngẫu nhiên. DNA được chuyển nhiễm thường tái tổ hợp trước khi hợp nhất làm cho thể hội nhập mang nhiều bản sao DNA trong tế bào. Hiệu quả chuyển nạp có thể tăng ở một vài dòng tế bào được xử lý dimethyl sulfoxide (DMSO) hoặc glycerol trong một thời gian ngắn (4-6 giờ) sau khi chuyển nhiễm. Xử lý sốc sau chuyển nhiễm bằng chloroquindiphosphate gây độc cao. Mức độ độc thay đổi giữa các dòng tế bào, đặc biệt các tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và các tế bào phân hóa ở giai đoạn cuối. Khi thay đổi calcium phosphate bằng DEAE-dextran thì chuyển nhiễm DNA có thể ít độc hơn với mọi xử lý sốc sau chuyển nhiễm ở tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và tế bào phân hóa.
1.2. Phương pháp lipofection
Sử dụng các lipid trung tính hoặc mang cation để tạo thành các liposome. Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích DNA dính bám vào trong phần bào tan (cytsol). Phương pháp này cho hiệu suất chuyển nạp cao hơn chuyển nhiễm bằng DEAE-dextran hoặc calcium phostphate. Tính đồng nhất của thành phần lipid giữa màng tế bào vật chủ và lipofectant làm tăng hiệu quả dung hợp và tăng khả năng xâm nhập của DNA gắn kèm. Các liposome mang cation (lipofectin) thích hợp cho chuyển nạp gen in vitro với hiệu suất trên 90% ở một số loại tế bào nuôi cấy. Lipofectin được sử dụng để bọc các virus. Việc tạo ra các liposome chứa protein virus trong lớp lipid đã cải thiện hiệu quả của vector với các tế bào đặc biệt, như là tế bào ung thư gan (liver hepatocytes). Chỉ có một số phương pháp thích hợp để chuyển DNA qua màng huyết tương bằng thực ẩm bào (endocytosis) và đẩy mạnh các quá trình nội thể gây thoái biến và sắp xếp lại DNA. Liposome được dùng để phân phối in vivo và ex vivo các gen người tới tế bào đích thích hợp.
1.3. Phương pháp xung điện (electroporation)
- Yêu cầu nghiêm ngặt các thông số của thiết bị tạo xung điện (Hình 5.4) liên quan đến hiệu suất xâm nhập của DNA. Dòng điện được sử dụng để tạo ra các tế bào treo trong dung dịch DNA các lỗ thủng trên màng huyết tương và qua đó DNA theo gradient mật độ chui vào trong phần bào tan. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy dịch huyền phù lymphocyte (lympho bào).
- Chuyển nạp gen bằng xung điện có khuynh hướng tạo ra các thể hội nhập mang bản sao DNA đơn và thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào mầm phôi. Việc chuyển nạp gen thông qua điện trường ở các tế bào máu (hematopoietic cells) và các thế hệ tổ tiên của chúng là phương thức thích hợp cho các virus vector đòi hỏi hệ thống đóng gói phức tạp.
- Các tế bào tủy xương tổ tiên (bone marrow progenitor cells) được nuôi trong môi trường có cytokin, interleukin-3 sẽ tăng tần số chuyển nhiễm và biểu hiện gen ở các tế bào tạo bạch cầu hạt (granulopoietic) và thể hồng cầu (erythroid) tổ tiên. Các gen chọn lọc trội như là pSVNeo ghi mã cho các gen của prokaryote, neomycin phosphatransferase (neo) mang gen khởi động (promoter) và gen tăng cường (enhancer) của Simian Virus 40 (SV40), cho phép phân lập các tế bào kháng neomycin bằng cách dùng một dạng đồng đẳng của neomycin, G418, trong môi trường bổ sung. Chuyển nạp gen pSVNeo bằng xung điện vào trong tế bào mầm tủy xương cho kết quả tốt, và có thể ứng dụng để chuyển nạp cDNA của yếu tố đông máu (factor IX) vào trong tế bào đệm (stromal cells) có nguồn gốc tuỷ xương.
1.4. Phương pháp vi tiêm (microinjection)
- Đây là phương pháp chuyển DNA trực tiếp nhất và có hiệu quả cao. Tuy nhiên, số lượng tế bào thí nghiệm giới hạn chỉ trong vài trăm. Kỹ thuật tinh xảo và thiết bị đắt tiền của vi tiêm (Hình 5.5, 5.6 và 5.7) đã hạn chế sử dụng rộng rãi phương pháp này. Tiến bộ lớn nhất của phương pháp vi tiêm là khả năng giám sát biểu hiện của DNA ngoại lai ở các tế bào riêng rẽ.
- Hơn nữa, trong khi chuyển nhiễm và chuyển gen bằng xung điện có thể vô cùng độc thì vi tiêm phân phối DNA trực tiếp vào trong nhân tế bào mà không gây nguy hiểm đến sự nguyên vẹn của màng tế bào. Để giảm độc tính tới mức tối thiểu, thể tích DNA phải được hạn chế nhỏ hơn 10% thể tích nhân.
- Đặc trưng của vi tiêm là cung cấp phương thức để tạo ra các động vật được chuyển gen, đánh giá biểu hiện gen được tạo dòng trong các tế bào phôi, cung cấp phương pháp trực tiếp để tạo các đột biến thêm đoạn (insertional mutants), xác định các nhân tố điều hòa biểu hiện gen đặc trưng mô và đặc trưng tế bào, và phân lập các dòng provirus (các virus DNA được hợp nhất trong DNA nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ) nguyên vẹn của các retrovirus (các virus mang RNA sợi đơn được tái bản thông qua DNA sợi đôi trung gian) để tiến hành phân tích bệnh lý học.
Xác định phương pháp chuyển nạp thích hợp cho các gen ngoại lai đặc trưng là cần thiết để thực hiện liệu pháp sữa chữa gen in vivo. Một vài bệnh di truyền xuất hiện do thiếu các gen chức năng hoặc sản phẩm gen vì vậy thay thế một gen khiếm khuyết bằng một gen bình thường có thể sữa chữa được khuyết tật và tránh các đột biến tiềm tàng ở các locus ngẫu nhiên. Gen thay thế phải được thiết kế thích hợp để thực hiện tái tổ hợp tương đồng giữa DNA ngoại lai và DNA nội sinh. Tần số tái tổ hợp tương đồng ở locus đích (target locus) trung bình là 1/103 tế bào nếu dùng phương pháp vi tiêm. Ở chuột chuyển gen, gen đặc trưng đã được nghiên cứu để cung cấp một hệ thống mô hình in vivo cho phép đánh giá hiệu quả của biện pháp thay thế gen. Mô hình động vật cho hội chứng Lesch-Nyhan tạo thuận lợi để đánh giá các quy trình chuyển nạp gen in vivo, cho dù bệnh học của động vật hiếm khi tương tự như ở người.
1.5. Phương pháp dùng súng bắn gen (gen gun)
Sử dụng các hạt kim loại như tungsten hoặc vàng làm vi đạn. Vi đạn được bọc bằng DNA và đi với một vận tốc thích hợp để xâm nhập vào tế bào đích. Hiệu quả của phương pháp này tương đương với phương pháp chuyển nhiễm. Sự biểu hiện thành công của DNA ngoại lai trong tế bào chuột NIH 3T3, tế bào khỉ COS 7 và một dòng đại thực bào (macrophage) đã được thông báo. Súng bắn gen và phương pháp tiêm trực tiếp DNA trần của plasmid bị hạn chế đối với tim và các tế bào cơ xương của động vật. Chỉ có 1-3% tế bào nhận DNA và sản xuất một lượng nhỏ protein được ghi mã. Các phương thức hiện hành hầu hết đều thích hợp cho các mục đích phát triển liệu pháp DNA vaccine trong đó với một lượng nhỏ protein là đủ để tạo ra một phản ứng miễn dịch (xem thêm chương 4).
1.6. Phương pháp dùng các virus vector
Đây là các cấu trúc tái tổ hợp trong đó một hoặc nhiều gen của virus được thay thế bởi DNA tạo dòng. Chuyển nạp gen đặc trưng mô hoặc tế bào được thực hiện bằng cách chọn lọc các điểm thụ cảm của tế bào đặc hiệu virus. Virus mang DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào đích đặc trưng và phân phối tải trọng di truyền vào trong chúng. Một đặc điểm hấp dẫn của virus vector là điều hòa biểu hiện gen khi có mặt promoter và enhancer của virus. Các virus vector có nguồn gốc từ hầu hết các virus DNA, bao gồm SV40, các virus tạo u dạng nhú (papilloma virus) ở người và bò, nhóm virus DNA của Parvoviridae (adeno-associated virus, AAV), adenoviruses (các virus mang DNA sợi đôi), các virus gây bệnh mụn giộp (herpes), và virus bệnh đậu mùa (vaccinia). Kích thước của đoạn chèn (insert DNA) thay đổi từ 2-3 kb ở các papovavirus tới > 50 kb ở vaccinia. Các virus vector có thể cho phép biểu hiện trong thời gian ngắn và gần như 100% ở điều kiện in vitro. DNA của provirus được sản xuất nhờ phiên mã ngược RNA của retrovirus hợp nhất như là một bản sao đơn trong nhiễm sắc thể vật chủ, giảm tới mức tối thiểu sự phiên mã gen. Các virus vector đặc biệt được thiết kể để phân phối DNA ngoại lai vào trong các tế bào phân hóa, các tế bào mầm phôi, các lymphocyte. Mặc dù các retrovirus đã được sử dụng để chuyển gen nhưng cũng có một vài khó khăn do provirus của nó thiếu khả năng hợp nhất vào các tế bào thụ động, bởi vì DNA chỉ hợp nhất khi tế bào trải qua thời kỳ phân bào. Điều này dẫn tới thất bại khi biểu hiện ở mức độ cao các gen chuyển nạp. Để có khả năng tái tổ hợp, kích thước tối đa của insert DNA chỉ khoảng 7 kb. Chọn lựa một phương pháp chuyển gen thích hợp phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm và loại tế bào đích (dính bám hay dịch huyền phù), chúng là những tế bào sơ cấp hay đã thích nghi, đã phân hóa hay có nhiều tiềm năng. Thử nghiệm biểu hiện của DNA chuyển nhiễm có thể là tạm thời (trong thời gian ngắn) hoặc bền vững (ổn định) với các mức độ biểu hiện cơ bản hoặc có thể suy diễn. Các dòng tế bào dính bám dễ thao tác bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau và cho biểu hiện gen thành công sau đó. Khi độc tính của phương pháp chuyển nhiễm loại trừ khả năng biểu hiện gen, thì một trong các phương pháp khác có thể cho phép thiết kế thí nghiệm thành công. Khi phương pháp chuyển nhiễm, xung điện và virus vector thất bại thì phương pháp vi tiêm có thể sẽ thích hợp. Chuyển nạp gen vào các tế bào không dính bám khó thực hiện nhưng sử dụng virus vector và chuyển nhiễm DEAE, cũng như liposome có thể là giải pháp hợp lý. Đối với các tế bào không dính bám thì có thể sử dụng phương pháp vi tiêm để chuyển gen.
Nồng độ DNA dùng trong thí nghiệm chuyển gen thay đổi từ 1 ng đến 10 μg cho 105-106 tế bào nhận. Trong vi tiêm, một vài trăm tế bào được tiêm trực tiếp DNA nồng độ từ 1 pg đến 10 μg/μL tương đương với 1-102 bản sao của cấu trúc tái tổ hợp. Số lượng bản sao đưa vào trong các tế bào nhận (tế bào vật chủ) tỷ lệ với kích thước của vector, đoạn chèn và nồng độ DNA. Các cấu trúc mạch thẳng hợp nhất thông qua tái tổ hợp cao hơn khoảng 10 lần các cấu trúc mạch vòng. Chuyển nhiễm thông qua liposome trở thành một kỹ thuật phổ biến nhờ độc tính thấp hơn và hiệu quả chuyển nạp cao. Trong khi phương pháp xung điện đòi hỏi một số lượng lớn DNA (10-40 μg) và trung bình sẽ giết chết một nữa tế bào nhận.
2. Các điều kiện cần thiết cho biểu hiện gen ngoại lai
Sau sự vận chuyển hiệu quả DNA vào trong nhân của tế bào nhận, biểu hiện của DNA ngoại lai tùy thuộc vào các nhân tố điều hòa: enhancer và promoter trình tự cis 5’ và các nhân tố phiên mã tác động trans (trans-acting) của tế bào vật chủ. Promoter và enhancer là các nhân tố có thể được chuyển vào trong vector để điều hòa biểu hiện gen sau khi hợp nhất vào trong DNA tế bào. Hiểu biết cơ chế điều hòa của gen chuyển nạp sẽ chọn được tế bào vật chủ cho phép các nhân tố phiên mã thích hợp hiện diện vào hoạt động. Cấu trúc một vector chuyển nạp gen thích hợp bao gồm các nhân tố điều hòa eukaryote và prokaryote cần thiết để thực hiện khuếch đại trong môi trường prokaryote và biểu hiện sản phẩm protein mong đợi trong vật chủ eukaryote.
Sự điều hòa của prokaryote được kết hợp với sự khuếch đại DNA tái tổ hợp trong E. coli hoặc các tế bào vật chủ prokaryote khác. Điều kiện tối thiểu là phải có vùng khởi đầu sao chép (ori) vi khuẩn, promoter vi khuẩn và gen chỉ thị chọn lọc hoặc sàng lọc để phân lập DNA tái tổ hợp được khuếch đại. Các gen chỉ thị được sử dụng như gen neomycin transferase (neo), thymidine kinase (tk), xanthineguanine phosphoribosyl transferase (xgprt), kháng methotrexate nhờ dihydofolate reductase (dhfr), kháng hygromycin (hgr) và kháng tetracycline (tet). Các gen chỉ thị là các gen prokaryote được tạo dòng trong các vector biểu hiện ở các eukaryote cho phép thử nghiệm biểu hiện tạm thời của DNA ngoại lai nhưng không phụ thuộc vào môi trường chọn lọc. Các gen chỉ thị là β-galactosidase (β-gal), luciferase (luc), chloramphenicol acetyl transferase (cat) và green fluorescent protein (gfp). Các sản phẩm protein của mỗi gen tương ứng là B-GAL, LUC, CAT và GFT.
Nói chung, các promoter eukaryote rất phức tạp, đòi hỏi hai hoặc nhiều trình tự cis mà nhân tố phiên mã liên kết thành hàng RNA polymerase II để phiên mã. Các nhân tố promoter tối thiểu bao gồm các lớp protein liên kết DNA thường gặp AP-1 và SP-1 được xem là các nhân tố bảo thủ tìm thấy nhiều trong promoter của eukaryotic virus. Tạo dòng trở lại (subcloning) promoter 5’ của virus vào trong các gen mã hóa các sản phẩm protein chọn lọc sẽ tạo điều kiện cho một số vector biểu hiện. Các promoter của virus hoạt động mạnh trong một số loại tế bào nuôi cấy đặc biệt nhưng lại hoạt động không giống nhau ở các tế bào phân hóa hoặc các tế bào phôi. Nhiều gen eukaryote quan tâm bắt nguồn từ mRNA thông qua phiên mã ngược để sản xuất cDNA không chứa các nhân tố điều hòa. Tạo dòng cDNA vào trong các vector mang promoter có hiệu lực và tất yếu để biểu hiện trong tế bào nhận. Các promoter SV40 và CMV (cytomegalovirus) cũng chứa các nhân tố enhancer là nhân tố làm tăng hiệu quả của promoter virus trong hầu hết các tế bào eukaryote. Các nhân tố enhancer có nguồn gốc từ virus tăng hiệu quả phiên mã của promoter.
Vùng khởi đầu sao chép eukaryotic DNA có thể được gắn vào vector để tăng sự sao chép với hàng triệu DNA tế bào. Trong thực tế, tất cả các vùng khởi đầu sao chép DNA của eukaryote có nguồn gốc từ hệ gen của virus. Sự sao chép phụ thuộc vào DNA polymerase và accessory protein của các tế bào cũng như replicase đặc trưng của virus. Để duy trì ổn định DNA ngoại lai đòi hỏi hoặc là DNA được hợp nhất trong nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ hoặc là tồn tại sự bổ trợ đặc trưng giữa episome và protein tác động từ ngoài (trans-acting protein).
Phiên mã eukaryote khởi đầu tại hướng của promoter nhưng lại kết thúc không chính xác. Phức nhân RNA-hnRNA dị hợp (heterogenenous nuclear RNA) là thể phiên mã sơ cấp (5’→3’), một bản sao chính xác của sợi DNA khuôn mẫu (3’→5’), và tương đương với sợi mã hóa của DNA (5’→3’). Khi có mặt intron, các spliceosome sẽ loại intron ở ranh giới đặc trưng exon-intron gắn cùng với chuỗi mã hóa được biểu hiện của gen trong một khung đọc mở để dịch mã. Các bước của quá trình này là đặc trưng của tế bào eukaryote và không xuất hiện trong các tế bào prokaryote. Sự điều hòa biểu hiện của gen de novo trong eukaryote phức tạp hơn sụ điều hòa dịch mã và các bước của quá trình sau dịch mã. Sự điều hòa tiếp theo có thể bao gồm khả năng ổn định của mRNA, các tín hiệu chỉ thị (maker signals) trong vùng không dịch mã 5’ hoặc 3’ (UTR) của mRNA, các chuỗi mang bộ ba mã hóa khởi đầu tối ưu… Các hiểu biết ban đầu về cơ chế phức tạp và tinh vi của sự điều hòa gen là cơ sở để chuyển nạp gen thành công ở điều kiện in vitro và in vivo. Liệu pháp gen ở người đòi hỏi thông tin chi tiết về gen bẩm sinh và xác định các nhân tố điều hòa để biểu hiện gen thích hợp.
3. Các điều kiện thực nghiệm tối ưu
Các nhân tố cần thiết để tối ưu thực nghiệm bao gồm số lượng tế bào, nồng độ DNA, điều hòa biểu hiện gen trong các tế bào nhận, và chọn lựa các hệ thống phân tích. Có thể xác định đặc trưng điều hòa của gen trong các môi trường tế bào khác nhau bằng cách phân tích biểu hiện tạm thời như CAT, B-GAT, hoặc GFP. Để phân tích biểu hiện ổn định bền vững có thể sử dụng các gen chỉ thị như β-gal, hoặc các gen đánh dấu chọn lọc như neo. Chi tiết của mỗi thí nghiệm phân tích được trình bày trong các Kit chuẩn và các hướng dẫn cặn kẽ trong đó để chọn lựa những ưu điểm và nhược điểm của từng phương pháp.
Các plasmid mang gen chỉ thị không chọn lọc như biểu hiện LUC hoặc GFP rất hữu ích khi làm việc trên môi trường không có áp lực chọn lọc. Gen mã hóa GFP (gfp) được tạo dòng từ loại sứa phát sáng sinh học (Aequorea victoria). Đặc tính hấp dẫn nhất là sự đơn giản của phép phân tích phát hiện do chỉ cần kính hiển vi huỳnh quang chuẩn và không cần cơ chất hoặc các cofactor khác. Các phân tích hóa miễn dịch và miễn dịch huỳnh quang cho phép phát hiện các tế bào nhận bằng mắt thường và quan sát chặt chẽ sự hợp nhất của cấu trúc tế bào. GFP là gen duy nhất trong số các gen chỉ thị có thể phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang ở các tế bào, có thể theo dõi sự sử dụng và biểu hiện của các protein chỉ thị trong phân chia tế bào ở giai đoạn tiếp theo và phân loại các tế bào biểu hiện bằng cách sử dụng máy sàng lọc các tế bào có hoạt tính phát huỳnh quang.
Gen gfp được tạo dòng trở lại trong các retrovirus vector mang đoạn lặp lại tận cùng dài (long terminal repeat-LTR) của virus, các vị trí tạo dòng, và gen kháng neo ngược hướng của LTR mang đầu tận cùng 3’. Chuyển các vector GFP vào trong các tế bào COS-7 biểu hiện mức độ huỳnh quang của protein có thể phát hiện trong 24-48 giờ mà không cần cố định. Các retrovirus vector mang GFP cho phép chuyển nhiễm dòng đã được đóng gói và sau 24 giờ các tế bào có thể được phân lập bằng máy phân loại tế bào có phát huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS) và tiến hành nuôi cấy. Máy đếm bằng phương pháp nhuộm propidium iodide sẽ phát hiện các tế bào chết và tách chúng ra khỏi tế bào sống biểu hiện GFP trong quá trình phân tích FACS.
4. Đồng chuyển nạp gen chỉ thị và gen thử nghiệm
Chuyển nạp gen bằng cách dùng hai plasmid, một mang DNA quan tâm và một mang gen chỉ thị, như neo, β-gal, luc hoặc gfp, vào trong các tế bào động vật có vú thường đánh dấu các tế bào biểu hiện DNA ngoại lai. Thí nghiệm đồng chuyển nạp đầu tiên bắt đầu năm 1979 với các gen β-globin và tk của virus herpes. Tiếp đó, nhiều quá trình tái tổ hợp gen chọn lọc và không chọn lọc đã được sử dụng bằng nhiều phương pháp chuyển gen và đã thu được nhiều thành công khác nhau. Nếu gen chỉ thị hoặc gen chọn lọc được biểu hiện trong tế bào nhận, thì gen thứ hai (gen quan tâm) cũng sẽ được biểu hiện. Khi gen chọn lọc được sử dụng để phân lập các quần thể tế bào biểu hiện gen đánh dấu trội, thì các tế bào tương tự sẽ được theo dõi cho kiểu hình của gen thứ hai. Chẳng hạn, gen chỉ thị trội pSVneo cho phép chọn lọc các tế bào trên môi trường G418 trong đó gen quan tâm thứ hai có thể được theo dõi cho kiểu hình đặc trưng. Vi tiêm pSVneo vào tế bào NIH3T3 đã sản xuất 35% khuẩn lạc kháng neo. Vi tiêm gen ras (một loại oncogene) được tạo dòng, có nguồn gốc từ ung thư bàng quang người, thì có từ 10-20% tế bào biểu hiện kiểu hình được chuyển nạp. Vi tiêm các tế bào NIH3T3 với cả hai gen ras và neo cho phép chọn lọc các tế bào kháng neo, trong đó 50% của chúng có kiểu hình oncogene.
Hệ thống chọn lọc kép với hai gen chọn lọc được sử dụng như hygromycin và neomycin, đòi hỏi xác định cẩn thận các điều kiện thí nghiệm. Độc tính kết hợp với sự chọn lọc trong G418 và hygromycin đã giới hạn khả năng sống sót của tế bào, đặc biệt ở các dòng tế bào sơ cấp và phân hóa. Phương pháp vi tiêm mẫn cảm hơn 100 lần so với phương pháp chuyển nhiễm khi chuyển gen ras vào các nguyên bào sợi dị bội của người đã được bất tử bởi kháng nguyên SV40T. Một tế bào, c-rasSVneo-HAL, đã được hình thành bằng kỹ thuật vi tiêm pSV2neoT24 sau khi không thành công với các kỹ thuật lipofection, chuyển nhiễm và xung điện. Tần số biểu hiện ras p21 kém hơn 10% trong thử nghiệm tạm thời và 1% cho biểu hiện ổn định.
Vi tiêm trực tiếp vào 100-200 tế bào cho cơ hội quan sát các phản ứng nội bào riêng rẽ tới các đại phân tử. Antisense oligodeoxynucleotide (ODN) và peptide nucleic acid (PNA) cung cấp một chiến lược mới cho liệu pháp gen trong tương lai. Đánh giá phản ứng trả lời sợi đối nghĩa (antisense) của gen đích (target gene) được thực hiện bằng cách dùng phương pháp vi tiêm ở hệ thống mô hình. Mô hình xây dựng để phân tích hiệu quả ODN và PNA được thiết kế đặc biệt. Gen đích là đơn vị phiên mã sớm của DNA ở SV40 mã hóa cho kháng nguyên T lớn. Các tế bào chứa bản sao hợp nhất đơn của DNA SV40 với kháng nguyên T lớn mẫn cảm nhiệt độ (tsA8) được dùng để đánh giá sự kìm hãm của kháng nguyên SV40 sau khi vi tiêm các cấu trúc PNA và ODN của sợi không có nghĩa (missense) và sợi đối nghĩa. Đồng tiêm β-gal cho phép phát hiện các tế bào được vi tiêm riêng rẽ nhờ phân tích miễn dịch huỳnh quang kép cho kháng nguyên T và β-gal. Hai chrome huỳnh quang (fluorochromes) riêng biệt cho phép xác định số phần trăm tế bào biểu hịên β-gal có hoặc không biểu hiện kháng nguyên T như là kết quả của sự ức chế sợi đối nghĩa. Vi tiêm PNA có từ 15-20 b vào nhân đã ức chế hòan toàn biểu hiện cơ bản của kháng nguyên T ở SV40. Sự ức chế đặc hiệu đã được chứng minh trên cơ sở không có sự khử trong gen β-galactosidase được đồng tiêm. PNA của sợi không có nghĩa không khử kháng nguyên T ở SV40 mà cũng không biểu hiện β-gallactosidase.
Tiếp đến các tế bào thận thích nghi của khỉ (CV-1) đã được vi tiêm plasmid biểu hiện kháng nguyên T của SV40 và một plasmid phân chia chứa β-gal được điều hòa bởi promoter CMV. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang kép được dùng để xác định số lượng biểu hiện của β-gal như một nhân tố chỉ thị của một tế bào vi tiêm và sự có mặt hoặc vắng mặt kháng nguyên T được xem như một đơn vị đo số lượng của hiệu suất ức chế gen bởi sợi đối nghĩa ODN hoặc PNA. Một hệ thống thí nghiệm điều khiển cao như thế cho phép so sánh trực tiếp hiệu quả của tính đặc hiệu chuỗi oligonucleotide, sự biến đổi chiều dài và nồng độ, trong sự so sánh với nucleic cid peptide như là các lớp phân chia oligomer antisense.
5. Kỹ thuật tế bào mầm phôi, chuyển gen và tái tổ hợp tương đồng
Một phương thức khác rất hữu hiệu trong chuyển gen là đưa DNA ngoại lai vào các tế bào mầm phôi (embryonic stem-ES) (Hình 5.8a). Thiết lập một dòng tế bào ES, các tế bào được cấy chuyển từ khối tế bào bên trong của túi phôi (blastocyt) đang phát triển lên các tầng nuôi dưỡng9 hoặc vào môi trường có hoạt tính ức chế phân hóa (differentiation inhibiting activity-DIA), để duy trì trạng thái không phân hóa của chúng. DNA ngoại lai có thể được đưa vào trong các tế bào ES bằng một số phương thức sau: xung điện, chuyển nhiễm hoặc vi tiêm. Sau đó, các tế bào chọn lọc được đưa trở lại vào trong túi phôi và được dính vào trong con cái mang thai giả cho phép phát triển tới kỳ hạn sinh đẻ. Sự khác biệt quan trọng giữa các con của một số động vật thu được theo phương thức này so với những con vật thu được bằng kỹ thuật vi tiêm vào phôi một tế bào (one-cell embryo), đó là chúng tạo ra các thể khảm vì các tế bào mang gen được biến nạp chỉ chiếm một tỷ lệ nhất định của sinh khối tế bào bên trong của túi phôi. Tuy nhiên, phương thức này cung cấp các tế bào chuyển gen đóng góp vào dòng tế bào mầm (germline), sau đó một phương thức chọn giống thích hợp sẽ cho phép thiết lập một dòng chuyển gen
Việc đưa DNA ngoại lai vào trong tế bào ES có ý nghĩa hơn phương pháp vi tiêm vào phôi một tế bào nhờ ưu điểm thực tế là DNA ngoại lai có thể được thiết kế để tái tổ hợp tương đồng với bản sao nội sinh của nó (Hình 5.8b). Sự chọn lọc tiếp theo, các dòng đích chính xác có thể được nhận diện, hoặc bằng Southern blot hoặc phân tích PCR, và đưa trở lại vào trong các túi phôi vật chủ để sinh sản các thể khảm chuyển gen mong muốn. Một số phương thức đã được phát minh cho chọn lọc dương tính các thể tái tổ hợp tương đồng phối hợp với chọn lọc âm tính dựa theo sự hợp nhất ngẫu nhiên. Chọn lọc dương tính có thể hướng tới bằng cách ngắt quãng các chuỗi tương đồng trong vector đích với marker chọn lọc, như là gen neo kháng neomycine của vi khuẩn. Nếu vector hợp nhất trong genome trong một kiểu tương đồng, thì sau đó gen neor sẽ được kết hợp chặt chẽ trong germline. Mọi chuỗi bổ sung của vector mà không có vùng tương đồng sẽ bị mất. Bằng cách đặt gen HIV-1-tk trong vùng không tương đồng của vector đích, mọi tế bào duy trì gen này thông qua các trường hợp hợp nhất ngẫu nhiên sẽ bị giết chết trong sự hiện diện của các nucleoside nhân tạo thích hợp.
Sinh sản của các động vật chuyển gen bằng các phương thức thao tác tế bào ES. (b) Tiếp theo việc chuyển DNA, các tế bào ES mang thể tái tổ hợp tương đồng có thể được chọn lọc trước khi đưa vào trong túi phôi.