Hệ thống lên men (fermentor) đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men từ rất lâu
Các điều kiện chung
Hệ thống lên men (fermentor) đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men từ rất lâu. Đầu tiên, sự lên men (fermentation) là thuật ngữ dùng cho sản xuất ethanol. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau.
Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế chúng rất dễ vỡ và biến dạng. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mật độ tế bào thấp sẽ cho nồng độ sản phẩm thấp. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng đã vài chục năm. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác.
- Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách:
+ Sử dụng hệ lên men có cánh khuấy hình mái chèo.
+ Cung cấp khí trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone.
+ Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen. Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng. Tuy nhiên khúc lượn của tube dễ vỡ, đây là khó khăn và nó bị hạn chế đối với các hệ lên men quy mô nhỏ dùng trong phòng thí nghiệm.
- Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù.
- Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier8.
2. Nuôi cấy mẻ (batch culture)
Trong nuôi cấy mẻ, các tế bào cấy gây (các tế bào được tiếp vào-inoculum cells) được bổ sung vào thể tích tổng số của môi trường nuôi cấy (Hình 5.2). Trong suốt quá trình sinh trưởng, các tế bào sẽ sử dụng hết chất dinh dưỡng trong môi trường và tiết ra các sản phẩm phụ (by-product) (Hình 5.3). Sự sinh trưởng dừng lại khi cơ chất bị sử dụng hết hoặc sản phẩm phụ đã đạt đến một nồng độ có thể ức chế tế bào. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp nguyên nhân làm ngừng sinh trưởng tế bào vẫn chưa được làm rõ.
- Ở quy mô phòng thí nghiệm, các tế bào động vật có vú được duy trì bằng cách cấy chuyển với một số lượng ổn định trong các chai bẹt bằng nhựa có đáy nông (được gọi là T-flask hoặc Roux-bottle) chứa từ 10-100 mL môi trường:
+ Các tế bào dính bám sẽ gắn vào đáy chai, và những lần cấy chuyển sau phải dùng trypsin (một loại protease hòa tan được các protein bắc cầu) để tách rời tế bào.
+ Các tế bào dịch huyền phù gắn lỏng lẽo hơn tế bào dính bám và có thể lấy ra bằng cách lắc bình nuôi cấy. Điều cần thiết là lượng mẫu đưa vào không được quá ít. Khoảng 2×105 tế bào/mL hoặc hơn, là thường được dùng cùng với một ít môi trường đã gần hết chất dinh dưỡng của lần nuôi cấy trước đó (spent medium), trong môi trường này có thể chứa các nhân tố chưa biết có tác dụng kích thích sinh trưởng của chính tế bào. Một cách khác, môi trường đã sử dụng gần hết chất dinh dưỡng phải được loại bỏ bằng cách ly tâm để tránh các sản phẩm phụ gây ức chế có mặt trong môi trường.
- Trong nuôi cấy tế bào động vật có vú ở quy mô lớn, dung tích môi trường thường sử dụng là khoảng 200 L, dung tích này đáp ứng được yêu cầu sản xuất cho các protein trị liệu có giá trị cao. Nhưng dù vậy quá trình nuôi cấy vẫn đòi hỏi một số bước trung gian, bước đầu tiên chuyển tế bào từ nuôi cấy tĩnh tới bình nuôi có lắc hoặc bình nuôi xoay (spinner flask). Bình nuôi xoay, có trang bị cánh khuấy từ tính treo xuống từ nắp bình mà không tiếp xúc với đáy, được phát triển đầu tiên để tạo ra sự khuấy nhẹ cho nuôi cấy microcarrier, nhưng nay cũng được dùng cho nuôi cấy dịch huyền phù. Hệ số độ chia (scale-up factor) từ nuôi cấy tĩnh, hoặc các bình lắc không điều chỉnh pH, thường nhỏ hơn 5, nghĩa là một thể tích cấy gây ít nhất là 20% phải được dùng. Trong hệ lên men, nơi có mật độ tế bào cao hơn, thì hệ số độ chia có thể lên tới 10 (nghĩa là cấy gây 10% v/v hoặc ít hơn).
- Một nuôi cấy mẻ đặc trưng của tế bào hybridoma trong hệ lên men kéo dài từ 3-5 ngày và đạt tới mật độ tế bào là 2-5× 106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng cực đại đặc trưng (μ) của các tế bào hybridoma và myeloma khoảng 0,05/giờ. Lượng kháng thể đơn dòng được sản xuất trong nuôi cấy mẻ của tế bào hybridoma nằm trong khoảng từ 10-100 mg của protein/L. Ở quy mô lớn, sản xuất mẻ của kháng thể đơn dòng được tiến hành ở hệ lên men thùng khuấy loại 1 m3, trong đó mật độ tế bào lên tới 5× 106 tế bào/mL thu được sau 3,5 ngày. Sản xuất thương mại đầu tiên với các tế bào dính bám được thực hiện trong chai quay (Hình 5.2). Các chai quay được giữ trong một chuyển động không đổi bằng cách quay tròn và các tế bào dính bám sinh trưởng trên bề mặt chai. Một bề mặt đặc trưng từ 750-1500 cm2 với 200-500 mL môi trường sẽ cho sản lượng 1-2× 108 tế bào. Một diện tích bề mặt lớn hơn có thể thu được bằng cách dùng microcarrier trong các hệ lên men thùng khuấy.
3. Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng (fed-batch culture)
Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng, trong một nghĩa chính xác, được điều khiển cùng một phương thức như nuôi cấy thể ổn định hóa tính (chemostat culture), nghĩa là tốc độ sinh trưởng tế bào bị hạn chế bởi tốc độ pha loãng và cơ chất giới hạn sự sinh trưởng. Lý do để sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng (cơ chất bị giới hạn) trong quá trình nuôi cấy là sự giới hạn O2 và sự chuyển hóa bài tiết quá mức được ngăn ngừa, dẫn đến mật độ tế bào cao hơn nhiều so với nuôi cấy mẻ. Mặc dù nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng bị giới hạn glucose và glutamine nhưng nó cũng giải quyết được vấn đề chuyển hóa bài tiết quá mức trong tế bào động vật có vú. Bằng cách cung cấp một hỗn hợp cân bằng các chất dinh dưỡng, mật độ tế bào và nồng độ sản phẩm cũng được cải thiện hơn 10 lần so với nuôi cấy mẻ. Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng có thể kéo dài ít nhất tới một tháng, các quá trình nuôi cấy ở quy mô 15 m3 đã được mô tả và mật độ tế bào trong khoảng 1-1,4× 107 tế bào sinh trưởng/mL đã được thông báo.
4. Nuôi cấy thể ổn định hóa tính (chemostat culture)
Nuôi cấy chemostat là kiểu nuôi cấy có sự bổ sung liên tục môi trường sạch và sự chảy ra của chất lỏng nuôi cấy, đồng thời giữ thể tích nuôi cấy không đổi (Hình 5.2). Trong nuôi cấy vi sinh vật ở trạng thái ổn định (steady-state), mối quan hệ giữa tốc độ pha loãng (D) và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (μ) được biểu thị bằng đẳng thứcD=μ. Tuy nhiên, trong nuôi cấy tế bào động vật có vú, sự sinh trưởng của nuôi cấy cần phải được tính toán. Sự sinh sản của tế bào không chỉ thay thế sự hao hụt các tế bào sống sót (đang sinh trưởng) bị cuốn theo dòng chảy ra, mà còn thay thế cho các tế bào bị chết trong quá trình nuôi cấy. Do đó, có thể mô tả trạng thái ổn định cho tốc độ sinh trưởng như sau:
Trong đó, Nt là nồng độ tế bào tổng số (tế bào chết cộng với tế bào sống sót) và Nv là nồng độ tế bào sống sót. Từ quan hệ này cho thấy rằng μ lớn hơn D khi sự chết tế bào xuất hiện trong hệ thống. Nói chung, trong nuôi cấy chemostat của vi sinh vật, một chất dinh dưỡng riêng rẽ định ra giới hạn sinh trưởng và nồng độ sinh khối cực đại trong nuôi cấy phụ thuộc vào nồng độ của cơ chất định ra giới hạn sinh trưởng trong môi trường cung cấp dinh dưỡng. Hơn nữa, tốc độ tiêu thụ đặc trưng các chất dinh dưỡng khác độc lập với nồng độ của cơ chất định ra giới hạn trong môi trường cung cấp dinh dưỡng.
Trong nuôi cấy tế bào động vật có vú, môi trường chứa nhiều nguồn carbon và nitrogen, do đó để thiết lập sự sinh trưởng trạng thái ổn định được giới hạn bởi một chất dinh dưỡng riêng rẽ là khó khăn hơn. Mặc dù, một trong các nguồn năng lượng (glucose hoặc glutamine) có thể giới hạn hiệu suất sinh khối trong nuôi cấy trạng thái ổn định, tuy thế tốc độ tiêu thụ đặc biệt của các chất dinh dưỡng khác có thể phụ thuộc vào mức độ cung cấp nguồn năng lượng, hoặc vào nồng độ của một chất dinh dưỡng riêng biệt.
Nhiều hướng nghiên cứu tập trung tối ưu môi trường và sinh lý học của tế bào động vật có vú, như ảnh hưởng của μ lên sự tạo thành sản phẩm và ảnh hưởng của nồng độ O2 hòa tan, pH, nồng độ glucose và glutamine, nồng độ các vitamin và amino acid lên sinh trưởng và tạo thành sản phẩm, đã được khảo sát bằng cách dùng hệ nuôi cấy chemostat. Các quá trình sản xuất chemostat với reactor (bình nuôi) có thể tích lên tới 2 m3 đã dược mô tả.
Nuôi cấy chemostat cho các mục đích sản xuất có một vài nhược điểm. Thời gian nuôi cấy dài ngày (ít nhất là năm tuần) đã tăng đáng kể nguy cơ nhiễm bẩn, và thời gian cần thiết để tái thiết lập nuôi cấy trạng thái ổn định sau khi sự nhiễm bẩn xuất hiện lâu hơn việc tái khởi động các quá trình nuôi cấy mẻ hoặc mẻ có cung cấp chất dinh dưỡng. Hơn nữa, sự thừa nhận có giá trị của một quá trình sản xuất dựa trên nuôi cấy liên tục phải chứng minh rằng dòng tế bào được dùng là ổn định qua thời gian nuôi cấy.
5. Nuôi cấy perfusion
Trong nuôi cấy perfusion, sinh khối được tích lũy khi tế bào được giữ lại trong reactor nhờ bộ phận duy trì, trong khi môi trường sạch được đưa vào và môi trường đã hao hụt chất dinh dưỡng bị loại bỏ. Theo cách này, mật độ tế bào lên tới 3× 107 tế bào/mL và có thể đạt được nồng độ sản phẩm cao hơn trong nuôi cấy mẻ. Các bộ phận phân tách tế bào từ dịch lỏng nuôi cấy có thể được đặt bên trong hoặc bên ngoài reactor (Hình 3.2). Một vài hệ thống perfusion có thể được phân biệt, dựa trên phương pháp sử dụng để phân tách tế bào và môi trường:
- Bộ phận lọc-xoay (spin-filter) sử dụng buồng quay có lưới kim loại (đường kính lỗ 5-75 μm). Nhược điểm của spin-filter là dễ làm tắc nghẽn, dẫn đến giảm tốc độ dòng chảy môi trường qua màng lọc và cuối cùng bít kín tất cả mắc lưới của màng lọc.
- Một cách chọn lựa khác là màng lọc sợi rỗng (hollow fibre) có thể được dùng để phân tách tế bào từ dịch lỏng nuôi cấy. Việc làm tắc nghẽn màng lọc cũng có thể xuất hiện nhưng có thể chữa bằng cách dùng tia nước ngược. Các bộ phận lắng xuống, việc sử dụng mật độ hơi cao hơn của tế bào (so với môi trường) để phân tách các tế bào từ dịch lỏng nuôi cấy, đã được phát triển.
- Một bộ phận đặc biệt dùng trọng lực hấp dẫn để giữ tế bào trong reactor là màng lọc âm thanh (acoustic filter). Hệ thống này dùng sóng âm thanh tĩnh để tập trung các tế bào trong dòng chảy. Các tế bào tích lũy trong các giao điểm (node) của sóng và lắng ngược xuống đáy chất lỏng trong nuôi cấy, ngược lại với dòng chảy lên (up-flowing effluent stream). Cuối cùng, ly tâm được áp dụng như là một phương thức duy trì tế bào cho các quá trình quy mô lớn.
Các hệ thống nuôi cấy sợi rỗng có thể được thừa nhận là một loại đặc biệt của nuôi cấy nhỏ giọt trong đó tế bào được phân tách vật lý khỏi dòng chảy môi trường (Hình 5.2). Các tế bào được sinh trưởng trong một khối không gian siêu mao dẫn (extra capillary space), trong đó môi trường sạch được cung cấp thông qua một số lớn các sợi rỗng của màng (sự chuyển khối). Mật độ tế bào lên tới 108 tế bào/mL của không gian siêu mao dẫn có thể đạt tới và môi trường dòng chảy từ không gian này chứa một nồng độ cao của sản phẩm. Tuy nhiên, khi nồng độ tăng dần của các chất dinh dưỡng và sản phẩm được tạo thành trên khắp các sợi sẽ giới hạn khả năng của các khối sợi rỗng được thiết kế cho các bình nuôi (reactor) quy mô sản xuất lớn. Mặc dù vậy, các khối sợi rỗng vẫn dễ dàng sử dụng và được ứng dụng thành công trong các quá trình sản xuất thương mại.
6. Số lượng và chất lượng sản phẩm
Một sản phẩm được tinh sạch từ nuôi cấy tế bào động vật có vú không thể có 100% hoạt tính sinh học mà tùy thuộc vào những biến đổi trong kiểu glycosylation hoặc trên sự thóai biến phân giải protein. Hai thông số này chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Phương thức glycosyl hóa thay đổi trong phản ứng với nhiều nhân tố như kiểu nuôi cấy, pha sinh trưởng của nuôi cấy mẻ, dù tế bào được sinh trưởng trong các microcarrier hoặc trong dịch huyền phù, nồng độ glucose, nồng độ ammonium, hiệu quả của các hormone trong môi trường, sự hiện diện của huyết thanh, hàm lượng của protein và lipid trong môi trường, pH và nồng độ O2 hòa tan. Vì vậy, việc chọn các điều kiện sinh lý thích hợp trong một quá trình sản xuất là quan trọng để có được sự glycosyl hóa chính xác của một protein dược phẩm.
Không những chất lượng các sản phẩm động vật có vú mà toàn bộ hiệu suất của nuôi cấy tế bào động vật có vú bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số như pH, nồng độ các ion ammonia/ammonium và lactate, nồng độ serum, phương pháp nuôi cấy, tuổi nuôi cấy, lượng mẫu cấy gây và thành phần môi trường. Do sự phức tạp của sinh lý tế bào động vật có vú, trong sự phối hợp với các môi trường và phương pháp nuôi cấy khác nhau được sử dụng, thường là khó khăn trong việc tách riêng ra ảnh hưởng của một nhân tố đặc trưng. Tuy nhiên, thông số có một ảnh hưởng chính rõ rệt lên hiệu suất đặc trưng của các sản phẩm của tế bào động vật có vú đó chính là tốc độ sinh trưởng. Cả hai động học của sản xuất kết hợp có sinh trưởng và không sinh trưởng đã xảy ra.
Hiệu suất đặc trưng cũng có thể được cải thiện bằng các hợp chất không phải là thành phần bình thường của môi trường nuôi cấy tế bào. Một số dòng tế bào động vật có vú cho thấy có hiệu suất đặc trưng cao hơn trong môi trường mà ở đó áp lực thẩm thấu được tăng lên từ mức bình thường là 330 mosmol tới hơn 400 mosmol. Mặc dù chưa được hiểu đầy đủ, tuy nhiên ảnh hưởng này phụ thuộc vào dòng tế bào và môi trường cơ bản được sử dụng.
Số lượng sản phẩm được sản xuất bằng nuôi cấy có thể biểu diễn bằng phần trăm của lượng protein tổng số được sản xuất. Trong sản xuất kết hợp không sinh trưởng, khi tốc độ sinh trưởng tăng lên thì phần trăm của sản phẩm sẽ giảm xuống một lượng đáng kể. Ví dụ: tốc độ sinh trưởng đặc trưng của sản xuất protein trong dòng tế bào hybridoma đã được thông báo như sau 1,5 mg/109 tế bào × giờ ở tốc độ sinh trưởng đặc trưng 0,02/giờ. Lượng sản phẩm được sản xuất tương ứng với 28% protein tổng số. Dòng tế bào tương tự có tốc độ sản xuất đặc trưng thấp hơn nhiều (0,2 mg/109 tế bào × giờ) ở tốc độ sinh trưởng 0,058/giờ, và 1% của protein tổng số trở thành sản phẩm trong các điều kiện này. Mặt khác, trong dòng tế bào myeloma sản xuất kháng thể tái tổ hợp với các động học kết hợp sinh trưởng, phần trăm của protein sản phẩm tăng lên từ 18%-29% đã quan sát được khi tốc độ sinh trưởng tăng lên từ 0,016/giờ đến 0,042/giờ. Nuôi cấy tế bào động vật có vú thành công nhất trong sản xuất (nồng độ và hiệu suất) là sản xuất kháng thể đơn dòng với các tế bào hybridoma hoặc myeloma. Như đã trình bày ở trên, tiềm năng sản xuất của các tế bào động vật có vú là nhân tố không định ra giới hạn, nhưng đúng hơn là đó là nồng độ sinh khối có thể đạt được. Để đáp ứng yêu cầu này, nuôi cấy mẻ có cung cấp chất dinh dưỡngvà reactor sợi rỗng (hollow fibre reactor) đã được sử dụng để thu được các nuôi cấy mật độ tế bào cao của các tế bào hybridoma và myeloma. Sự giới hạn glucose và glutamine được phối hợp với việc cung cấp amino acid và huyết thanh, cho kết quả nồng độ tế bào tổng số xấp xỉ 5× 107 tế bào/mL (trong đó ít hơn một nữa là sống sót) sau hơn 550 giờ, và nồng độ cuối cùng của kháng thể là 2,4 g/L, ví dụ: cho một hiệu suất thể tích là 0,1 g/L × ngày. Sản xuất thương mại các kháng thể đơn dòng trong các reactor sợi rỗng có thể cho sản lượng khoảng 700 g sản phẩm/tháng ở khoảng 2 g/L. Mỗi lần chạy kéo dài khoảng ba tháng nhưng lần chạy đầu tiên là không sản xuất do thời gian này được yêu cầu cho việc xây dựng sinh khối trong không gian siêu mao dẫn. Hiệu suất trong hệ thống này là 0,3 g/L × ngày trong suốt thời gian thu hoạch.