Hotline

Sản xuất các dược liệu sinh học

Các hợp chất tự nhiên
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học dùng làm dược liệu rất có giá trị. Những sản phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong thực vật và không có chức năng trao đổi chất rõ ràng1. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật.
Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực vật ngoại sinh từ cây hoàn chỉnh được nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) trong điều kiện vô trùng. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật dựa trên tính toàn thể hóa sinh (biochemical totipotency)2 duy nhất của tế bào thực vật. Nhiều sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh. Có nhiều bằng chứng cho thấy có mối quan hệ ngược (feedback) giữa tốc độ sinh trưởng và sản xuất các chất thứ cấp. Khi tốc độ sinh trưởng cao, các quá trình sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và sản xuất sinh khối tế bào. Trong pha tĩnh, khi sự sinh trưởng giảm đến mức tối thiểu, sự sản xuất và tích lũy các chất thứ cấp sẽ tăng lên.
Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid3. Alkaloid có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid và được sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dung môi. Glycoside bao gồm các phenolic, tanin và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm.
1.1. Các alkaloid
Người ta cũng có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây Coffea arabica, betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberi n trong rễ, so với hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hương liệu và trong y học.
Chất reserpine có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn cũng được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào của cây này trong 30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn có thể sản xuất được 3.500 kg reserpine, tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó.
Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) đã sản xuất được loại alkaloid là scopolamine từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy. Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng và kỹ thuật gen, người ta đã tăng được sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần.
Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thường. Một số nghiên cứu đã phân lập được các dòng tế bào Cantharanthus sản xuất serpentin và ajmalacine từ nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt người ta đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào tốt nhất lên một mức cao hơn nữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalacine. Mới đây người ta đã hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy tế bào của cây Catharanthus roseus để sản xuất viblastine và vincristine là hai chất kháng ung thư rất mạnh, hiện đang có nhu cầu rất cao vì chúng được sử dụng để chữa ung thư máu.
Sikuli và cs (1997) sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy hàm lượng hyoscyamine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy < 100 mg/L.
1.2. Các steroid
Trong lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid, các dòng tế bào có năng suất cao đã được Kaul và cs đề cập đến từ năm 1969. Họ đã nuôi cấy thành công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sản xuất diosgenin, là nguyên liệu thô chủ yếu để sản xuất các steroid chống thụ thai và các hormone tuyến thượng thận.
Quá trình chuyển hóa các hợp chất glycoside tim (cardiac) bằng nuôi cấy tế bào của cây Digitalis lanata cũng đã được nghiên cứu. Người ta nhận thấy, mặc dù các tế bào Digitalis ngừng sản xuất glycoside tim nhưng chúng vẫn có khả năng hydroxyd hóa digitoxin ở nguyên tử 12C để tạo ra digoxin. Digoxin là một hợp chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa xảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu quả khi đưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày, người ta đã thu được 4 g β-methyl-digitoxin trong một bình nuôi dung tích 20 L.
1.3. Một số chất khác
Thí dụ điển hình nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon. Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên các nhà khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin.
Hàm lượng tương đối cao của ubiquinone-10 được tìm thấy trong tế bào thuốc lá nuôi cấy in vitro và của L-dopa trong môi trường nuôi cấy tế bào Mucuma pruriens. Nuôi cấy tế bào của cây Panax pseudoginseng đã cho hàm lượng saponin khá cao. Nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza glabra đã thu được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô.
Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào của cây Coleus blumei đó là chất rosmarinic acid chiếm 13-15% trọng lượng khô trong chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần so với hàm lượng trong cây trồng ở điều kiện tự nhiên. Trong những năm 1980, người ta cũng đã sản xuất rất có hiệu quả ginsengoside là họat chất chủ yếu của nhân sâm Panax ginseng. Các anthraquinone là một nhóm các sản phẩm tự nhiên quan trọng có ở vi khuẩn, nấm, địa y và thực vật bậc cao có các họat tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, giảm huyết áp, giảm đau, chống sốt rét chống oxy hóa, kháng bệnh bạch cầu và các chức năng đột biến. Ở thực vật bậc cao, chúng đã được tìm thấy ở rất nhiều họ thực vật khác nhau, chẳng hạn Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Leguminosae... Nuôi cấy tế bào các loài của họ Rubiaceae đã cho phép thu được một lượng lớn anthraquinone thậm chí trong một số trường hợp đã vượt quá hàm lượng anthraquinone ở cây bố mẹ.
2. Các protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) là protein tự nhiên được cải biến bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng cao hoặc thay đổi hoạt tính của chúng. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp. Các tế bào thực vật rất thích hợp cho các nguyên liệu tái tổ hợp do chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản không cần bổ sung protein. Nếu protein ngoại lai được sản xuất trong nuôi cấy tế bào và được tiết ra trong môi trường, nhiều hơn phần được tích lũy trong tế bào, thì việc thu hồi và tinh sạch sản phẩm có thể được tiến hành mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các protein có nguồn gốc thực vật an toàn cho người hơn các protein có nguồn gốc từ tế bào động vật bởi vì các chất nhiễm bẩn và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Ngoài ra, nuôi cấy tế bào thực vật cũng là một công cụ thực nghiệm thuận lợi cho việc khảo sát sự sản xuất protein ngoại lai trong cây hoàn chỉnh.
Bảng 4.4. Sản xuất các protein tái tổ hợp bằng nuôi cấy tế bào thực vật Protein
Loài thực vật
Hormone sinh trưởng ở người
Nicotiana tabacum
Albumin huyết thanh người
N. tabacum, Solanum tuberosum
Nhân tố sinh trưởng biểu mô ở người
N. tabacum
Nhân tố sinh trưởng ở cá hồi
N. tabacum
α-interferon người
Oryza sativa
Hirudin (chống đông máu)
N. tabacum
Erythorpoetin
N. tabacum
α and β haemoglobin người
N. tabacum
Human muscarinic cholinergic receptors
N. tabacum
GM-CSF chuột
N. tabacum
Interleukin-2 và Interleukin-4
N. tabacum
Alkalinephosphatase nhau thai người
N. tabacum
α1-antitrypsin người
O. sativa
Hormone sinh trưởng người
N. tabacum
GM-CSF người
N. tabacum, O. sativa
Thực vật chuyển gen hiện nay được xem là hệ thống sản xuất rất kinh tế cho việc sản xuất các protein ngoại lai như kháng thể, enzyme và hormone. Sản xuất thương mại một số protein của vi khuẩn và động vật đã được tiến hành bằng thực vật. Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của sản xuất protein dựa trên cơ sở thực vật là hiệu suất của protein ngoại lai hoặc nồng độ của sản phẩm được tích lũy trong sinh khối. Theo đó, người ta đã chú ý cải thiện sự biểu hiện gen ngoại lai trong cây chuyển gen thông qua việc phát triển các promoter tốt hơn, chọn lọc các dòng chuyển gen ổn định, và ức chế gen im lặng (silence gene). Tuy nhiên, một yếu tố quan trọng là sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm giảm nồng độ của sản phẩm chức năng trong mô thực vật sau khi các phân tử được tổng hợp và lắp ráp. Sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm bẩn sản phẩm với các đoạn protein mất hoạt tính, và người ta cũng gặp khó khăn khi loại bỏ các protein đứt gãy này trong các hoạt động thu hồi protein chức năng ở sản xuất quy mô lớn. Tìm hiểu chi tiết về vị trí và cơ chế của sự đứt gãy ở nội và ngoại bào là rất cần thiết để có thể phát triển phương pháp sao cho giảm thiểu được sự tổn thất protein sau dịch mã.
3. Vaccine thực phẩm (edible vaccine)
Cho đến thời gian gần đây người ta vẫn sử dụng vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi. Vaccine kiểu này có một số hạn chế như: có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể người và vật nuôi. Hiện nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh lỡ mồm long móng, bệnh dại và viêm gan B. Tuy nhiên, vaccine được sản xuất theo các phương pháp trên có giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng.
Vaccine thực phẩm là một mô hình lý tưởng cho các nước đang phát triển, vì nó giúp khắc phục được các khó khăn nói trên của vaccine được sản xuất theo phương pháp truyền thống hoặc DNA tái tổ hợp. Nguyên lý cơ bản của quá trình này là chuyển một loại gen đặc biệt vào tế bào thực vật. Loại gen này hoạt động trong cơ thể thực vật, sẽ biến thành nơi sinh ra protein kháng nguyên. Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể người thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống không nấu chín, nếu không sẽ làm mất hoạt tính kháng nguyên), hệ thống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Như vậy là đã thay việc tiêm chủng vaccine bằng việc ăn những hoa quả hoặc rau xanh có kháng nguyên. Một số ưu điểm chính của vaccine thực phẩm:
- Giá thành rẻ
- Ổn định
- Dễ dàng sản xuất trên quy mô lớn
- Dễ quản lý
- Không cần tinh sạch
- Bảo quản lâu
- Dễ vận chuyển
Một số kết quả bước đầu của vaccien thực phẩm:
- Sản xuất vaccine chống bệnh infectious bursan desease virus (IBDV) ở gà chuyển vào cỏ Arabidopsis.
- Chuyển gen ORF2 của virus gây bệnh viêm gan E vào cây cà chua, cây Pichia pastoris.
- Sản xuất vaccine viêm gan B trong cây chuối chuyển gen, cây cherry tomatillo (Physalis ixocarpa), yellow lupin, rau diếp và cà chua.
- Chuyển LT-B của E. coli gây bệnh đường ruột vào khoai tây.
- Chuyển gen CTB (dịch tả) của vi khuẩn Vibrio cholerae và LT-B vào cây thuốc lá và đang nghiên cứu chuyển vào một số cây trồng có giá trị khác như: cà chua, mía…
- Một nghiên cứu đã được công bố gần đây trong lĩnh vực sản xuất vaccine từ thực vật, đó là gây miễn dịch trong cơ thể người bằng vaccine thực phẩm để điều trị bệnh viêm gan B. Loại cây trồng được sử dụng để chuyển gen viêm gan B lần này là khoai tây. Người ta hy vọng rằng khi ăn loại khoai tây này, chất kháng nguyên sẽ gây ra một phản ứng miễn dịch nhẹ trong cơ thể người. Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra chất miễn dịch cá thể đối với căn bệnh lây nhiễm viêm gan B. 42 nhân viên chăm sóc sức khỏe ở độ tuổi 25-58 đã Công nghệ sinh học thực vật 139
tham gia vào cuộc nghiên cứu. Trong đó, 33 người được chỉ định ăn khoai tây chuyển gen mà không có tá dược, một chất làm tăng khả năng phản ứng miễn dịch. Chuẩn độ kháng nguyên kháng virus viêm gan B trong huyết thanh được đo trong một số lần nhất định mỗi ngày. Kết quả cho thấy đối với những người ăn khoai tây không chuyển gen các chuẩn độ không tăng, trong khi đó 19 trong số 33 người ăn khoai tây chuyển gen thì chuẩn độ tăng 57,6%, trong khi vaccine hiện có trên thị trường có tác dụng tới 90% đối tượng, kể cả khi có chứa chất tá dược.
 
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
 
Nguyễn Hoàng Lộc

X