Tinh sạch enzyme là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những enzyme có giá trị ứng dụng cao.
Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự chọn lựa kỹ thuật phân tách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn. Môi trường phân tách giống nhau thường được sử dụng trong các kỹ thuật khác nhau, nghĩa là sắc ký trao đổi ion được thực hành tốt nhất khi tách rửa dần dần từ cột ở quy mô nhỏ hơn, và bằng sự hấp phụ/tách rửa từng mẻ ở quy mô lớn hơn.
2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào
Sau khi phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch enzyme nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong phân lập enzyme, và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Nhiều quy trình có bổ sung một lượng nhỏ DNase ở giai đoạn này, để phá vỡ thêm các chuỗi DNA có thể làm cho dịch chiết trở thành dạng sệt (gelatinous).
2.2. Ly tâm mẻ
Ly tâm mẻ thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng từ nhỏ hơn 1 mL đến một vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm tương đối lớn lên tới 100.000 × g (hằng số hấp dẫn). Tuy nhiên, để loại bỏ các tế bào vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein, thì lực ly tâm đạt tới 20.000 × g là thích hợp. Nhiều thiết bị ly tâm loại này, thích hợp cho các quá trình tách chiết ở quy mô trung bình.
2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục
Do thể tích lớn của chất lỏng cần phải được thao tác bằng tay ở thời điểm bắt đầu của quá trình tinh sạch enzyme ở quy mô lớn, người ta thường dùng phương pháp ly tâm dòng chảy liên tục để loại bỏ các chất dạng hạt. Có ba loại ly tâm chính là thích hợp hơn cả là: ly tâm thùng rổng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng (multi-chamber) hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng (basket).
- Ly tâm thùng rổng có một rotor hình ống cung cấp một đường chảy dài cho dịch chiết được bơm vào trong đáy và chảy lên qua thùng. Chất lắng bị bắn vào thành của thùng, và dịch chiết được gạn sẽ chuyển lên để ra khỏi thùng vào trong bình thu. Khi ly tâm tiếp tục, đường kính thực tế của thùng giảm xuống, vì thế nó làm giảm đường lắng xuống và lực ly tâm có thể được áp dụng. Tốc độ dòng chảy phải được xác định theo kinh nghiệm vì nó rất khác nhau giữa các loại dịch chiết, nhưng tốc độ dòng chảy thích hợp cho các máy lớn là khoảng 60 lít/giờ.
- Ly tâm đĩa cung cấp các phương thức lý tưởng để gạn lọc các dịch chiết thô, và trong nhiều trường hợp chất lắng xuống có thể chảy ra ngoài mà không làm gián đoạn quá trình ly tâm. Thùng chứa một series đĩa xung quanh một hình nón ở giữa. Khi dịch chiết đi vào, chất hạt bị bắn ra ngoài, chạm vào các đĩa hình nón và chất lắng tập trung trên thành của thùng. Phương pháp này cung cấp một đường chảy không đổi, vì thế hiệu suất ly tâm ít bị hao hụt. Nhược điểm của kiểu ly tâm này là có hao hụt một ít sản phẩm trong suốt quá trình chảy ra ngoài. Ly tâm đĩa có thể đạt tới một lực ly tâm RCF (rotational centrifugal force) khoảng 8.000 × g và có sức chứa lên đến 20 kg chất lắng.
- Ly tâm thúng được thiết kế để hoạt động ở các lực ly tâm thấp hơn nhiều, có thể chỉ 1.000 rpm, về cơ bản đó là các bộ lọc ly tâm. Thùng được đục thủng lỗ và thường được lót bằng vải lọc. Ứng dụng chính của ly tâm này là để thu thập các hạt nguyên liệu lớn; trong phạm vi tinh sạch enzyme thì đó là các nguyên liệu trao đổi ion được dùng cho hấp phụ theo mẻ của protein mong muốn.
2.4. Lọc bằng màng
Lọc là một phương pháp khác để gạn các dịch chiết tế bào. Tuy nhiên, dịch nuôi cấy vi sinh vật và các dịch chiết có khuynh hướng trở thành dạng sệt tự nhiên thường khó khăn khi lọc bằng các phương pháp truyền thống, trừ khi diện tích màng lọc được sử dụng là rất lớn.
Có thể khắc phục điều này bằng cách dùng phương pháp lọc dòng chảy ngang (cross-flow) hoặc tiếp tuyến (tangential). Trong phương pháp này dịch chiết chảy ở góc phải theo hướng lọc, và sử dụng tốc độ dòng chảy cao có khuynh hướng giảm sự tắc nghẽn bằng các hoạt động tự làm sạch. Chẳng hạn để thu hồi ở quy mô lớn L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi người ta sử dụng một màng lọc có diện tích 1 m2 dùng để thu hoạch tế bào từ 100 lít của chất lỏng nuôi cấy trong 2,5 giờ lúc đó nồng độ các chất rắn ở phần được giữ lại trên màng tăng lên từ 0,55%-22% trọng lượng khô. Sau đó, một màng giống như thế được dùng để gạn lọc dịch chiết thu được bằng phân giải kiềm các vi khuẩn này. Các số liệu này đã chỉ ra rằng để thu hoach tế bào từ 500 lít nuôi cấy trong 2,5 giờ đòi hỏi màng 7,5 m2, và chi phí cho quá trình này ít hơn so với phương pháp ly tâm.
Do các giới hạn của ly tâm quy mô lớn nên hai kỹ thuật thường được phối hợp để đảm bảo rằng dịch chiết là thật sự sạch cho bước sắc ký tiếp theo.
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
Nguyễn Hoàng Lộc