Hiện nay, hằng năm thị trường enzyme thế giới tiêu thụ hơn 1,5 tỷ USD và người ta dự đoán con số này sẽ gấp đôi vào năm 2008
Enzyme là các loại protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất của một phản ứng hóa sinh chuyên hóa, mà sau phản ứng vẫn còn nguyên không bị phân hủy và giữ được khả năng xúc tác. Enzyme được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau nhờ có tính đặc hiệu cao và tác dụng trong điều kiện “êm dịu”, tất cả các enzyme có nguồn gốc tự nhiên đều không độc, các chế phẩm enzyme được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền.
Hiện nay, hằng năm thị trường enzyme thế giới tiêu thụ hơn 1,5 tỷ USD và người ta dự đoán con số này sẽ gấp đôi vào năm 2008. Trong vòng 10 năm qua, lượng enzyme được sản xuất hằng năm tăng lên 12%. Xấp xỉ 75% enzyme công nghiệp được sử dụng để thủy phân và khử trùng hợp (depolymerisation) các hợp chất tự nhiên phức tạp, trong đó protease chiếm ưu thế trong công nghiệp tẩy rửa và sản xuất bơ sữa. Các ứng dụng enzyme trong thực phẩm được xem là lớn nhất. Các ứng dụng này bao gồm chuyển hóa tinh bột thành glucose và fructose, phomát, rượu vang, bia, chất thơm, nước ép trái cây và thức ăn động vật (Bảng 6.1).
Sản xuất enzyme được phát triển mạnh từ những năm 1960 nhờ ứng dụng công nghệ lên men vi sinh vật và gần đây hơn là nhờ những thành tựu của công nghệ di truyền. Các cơ thể vi sinh vật tái tổ hợp (recombinant microorganisms) hiện nay trở thành nguồn nguyên liệu ưu thế cho sản xuất enzyme với sự đa dạng của các loại khác nhau. Hướng ứng dụng này chắc chắn sẽ phát triển mạnh trong tương lai nhờ sự tiện lợi của kỹ thuật di truyền và sự phong phú của các loại enzyme có sẵn ở vi sinh vật được tìm thấy trong các môi trường đa dạng và khắc nghiệt. Nhiều enzyme vi sinh vật sau khi được phát hiện đã được phát triển để thay thế các enzyme đang có từ nguồn gốc động vật và thực vật.
Bảng 6.1. Giá trị enzyme đối với công nghiệp công nghệ sinh học Enzyme công nghiệp
Giá trị thị trường
(triệu USD)
Các protein dược phẩm
100
Các chất tẩy (protease và lipase)
70
Công nghiệp sản xuất bơ sữa (hầu hết là rennin)
50
Nghiên cứu (đa dạng enzyme)
42
Chế biến tinh bột
31
Chẩn đoán (đa dạng enzyme)
16
Công nghiệp dệt
12
Công nghiệp nước uống
11
Bánh mì
4,5
Biến đổi sinh học (biotransformation)
4,5
Những cái khác
5
Tổng số
400
1. Các enzyme từ nguồn động-thực vật
- Các enzyme được sử dụng đầu tiên có nguồn gốc từ các nguyên liệu thực vật và động vật. Mặc dù, sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật có hiệu quả kinh tế cao hơn nhưng hiện nay vẫn còn nhiều quá trình sản xuất enzyme có hiệu quả nhờ vào các nguồn động-thực vật.
- Các cơ quan và mô của động vật cung cấp các nguồn nguyên liệu lý tưởng cho một số enzyme như lipases, esterases và protease, trong đó đáng kể nhất là rennet1, pepsin2, trypsin3 và chymosin4. Trứng gà vẫn là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất lysozyme. Các cây trồng được dùng làm nguồn nguyên liệu lý tưởng cho proteases như: bromelain từ dứa (thơm), papain từ đu đủ và ficin từ quả sung (Bảng 6.2).
- Nói chung, các nguồn động vật có khuynh hướng cung cấp enzyme tốt hơn các nguồn thực vật (Bảng 6.3). Mặc dù, các cây trồng nông nghiệp có thể được trồng đặc biệt cho sản xuất enzyme và một số tính chất giống nhau của sản phẩm được đảm bảo tốt. Nhưng tất cả cây trồng đều phụ thuộc vào sự thuận lợi của các điều kiện tự nhiên như thời tiết, thời vụ và khí hậu...
- Các nguyên liệu thô (mô) từ nguồn động vật và thực vật được ổn định thường bằng cách đông lạnh hoặc làm khô trước khi vận chuyển, cho phép thu thập một số lượng lớn đủ cho quá trình sản xuất enzyme theo từng mẻ.
Thông thường các nguyên liệu thích hợp không luôn luôn có sẵn và số lượng có thể bị hạn chế. Những hạn chế này có thể được cải thiện bằng sự phát triển các enzyme vi sinh vật với các hoạt tính tương tự và thực hiện lên men vi sinh vật trên quy mô lớn.
1 Rennet: enzyme dịch vị, lấy ở dạ dày bò con dùng làm đặc sữa khi chế biến phomát.
2 Pepsin: enzyme của dịch vị động vật có xương sống, xúc tác phản ứng phân giải các protein thành các amino acid hợp thành chúng.
3 Trypsin: enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong protein và thủy phân từng phần protein, dẫn xuất từ trypsinogen dịch tụy tiết vào ruột non, được enzyme ruột non enterokinase tác động chuyển thành.
4 Chymosin (rennin): enzyme đông sữa.
2. Các enzyme từ nguồn vi sinh vật
- Các vi sinh vật là nguồn enzyme thuận lợi nhất. Số lượng và sự đa dạng của enzyme tỷ lệ với số lượng và sự đa dạng của các vi sinh vật. Các vi sinh vật được thu thập từ các môi trường khắc nghiệt như suối nước nóng, vùng băng giá, rừng mưa nhiệt đới và sa mạc.
- Mỗi loài sinh vật có các vi sinh vật đặc trưng phối hợp và vì thế mức độ tiềm tàng của các hoạt tính enzyme là rất lớn. Các kỹ thuật của công nghệ di truyền cho phép công nghiệp enzyme tăng hiệu suất lên men của các enzyme này lên nhiều lần. Ngay cả tính chất của các enzyme này cũng có thể được biến đổi và cải thiện bởi công nghệ protein.
Bảng 6.2. Các enzyme từ nguồn thực vật Loài thực vật
Enzyme
Ứng dụng
Cây đậu nhiệt đới của Mỹ (Canavalia ensiformis)
Urease
Chẩn đoán
Đu đủ (Carica papaya)
Papain
Nướng, sản xuất bơ sữa, thuộc da, mềm thịt
Sung (Ficus carica)
Ficin
Mềm thịt
Dứa (Ananas comosus)
Bromelain
Nướng (khử phức hợp gluten)
Cây cải ngựa
(Armoracia rusticana)
Peroxidase
Chẩn đoán
Cây hạnh
(Amygdalus communis)
β-glucosidase
Nghiên cứu
Lúa mì (Triticum aestivum)
Esterase
Tổng hợp và thủy phân ester
Lúa mạch
(Hordeum vulgare)
β-amylase
Nướng, nước sirô maltose
Đậu tương (Glycine max)
β-amylase
Nướng, nước sirô maltose
Bảng 6.3. Các enzyme từ nguồn động vật Loài động vật
Enzyme
Bê, bò, dê con, cừu non, lợn
Diastase (amylase), pre-gastric esterase, lipase, pepsin, trypsin, phytase, chymosin (rennin), phospholipase
Trứng gà
Lysozyme
Nước tiểu người
Urokinase
Nhiều enzyme bị ức chế tự nhiên và chỉ có thể được biểu hiện dưới các điều kiện nuôi cấy nhất định. Các enzyme này có thể là nội bào, đặc trưng ở trường hợp E. coli, và ngoại bào như ở các loài Bacillus. Các chủng thương mại của các loài Bacillus và Aspergillus không tái tổ hợp có thể sản xuất enzyme tới nồng độ 20 kg/m3. Các nuôi cấy tái tổ hợp cũng có thể sản xuất enzyme ở các hiệu suất tương tự hoặc hơn.
3. Các enzyme đặc trưng loài
Một số các chủng Aspergillus có thể sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau. Do các quá trình lên men phát triển tốt, Asper. niger cũng được sử dụng rộng rãi như một vật chủ cho sự biểu hiện của các enzyme tái tổ hợp. Loài này được biết có thể sản xuất hơn 40 enzyme thương mại khác nhau, trong đó những enzyme phổ biến nhất được trình bày ở bảng 6.4.
Bảng 6.4. Các enzyme được sản xuất bởi Aspergillus niger Lipase
Pectin esterase
Amyloglucosidase
Cellulase
Pentosanase
Catalase
Protease
α-galactosidase
α-amylase
Inulinase
Phospholipase
β-glucanase
Phytase
Galactomannase
Glucose oxidase
Arabinase
Pectinase
Tương tự, enzyme cũng có thể được sản xuất từ các loài vi sinh vật khác, ví dụ có bảy nguồn vi sinh vật khác nhau cho sản xuất glucose isomerase và tám cho α-amylase (Bảng 6.5).
Bảng 6.5. Các nguồn phổ biến của α-amylase và glucose isomerase α-amylase
Glucose isomerase
Các loại ngũ cốc tạo malt
Actinoplanes missouriensis
Tuyến tụy của động vật
Bacillus coagulans
Aspergillus oryzae
Mycobacterium arborescens
Aspergillus niger
Streptomyces murins
Bacillus amyloliquefaciens
Streptomyces olivaceous
Bacilus licheniformis
Streptomyces olivochromogens
Bacillus stearothermophilus
Streptomyces phoenics
Bacillus subtilis
Endomyces spp.
Rhizopus oyzae
Tương tự, enzyme cũng có thể được sản xuất từ các loài vi sinh vật khác, ví dụ có bảy nguồn vi sinh vật khác nhau cho sản xuất glucose isomerase và tám cho α-amylase (Bảng 6.5).
Bảng 6.5. Các nguồn phổ biến của α-amylase và glucose isomerase α-amylase
Glucose isomerase
Các loại ngũ cốc tạo malt
Actinoplanes missouriensis
Tuyến tụy của động vật
Bacillus coagulans
Aspergillus oryzae
Mycobacterium arborescens
Aspergillus niger
Streptomyces murins
Bacillus amyloliquefaciens
Streptomyces olivaceous
Bacilus licheniformis
Streptomyces olivochromogens
Bacillus stearothermophilus
Streptomyces phoenics
Bacillus subtilis
Endomyces spp.
Rhizopus oyzae
4. Sản xuất enzyme trên quy mô lớn
Nuôi cấy các vi sinh vật trên quy mô lớn là phương pháp kinh tế nhất do có các ưu điểm sau :
- Sử dụng các môi trường đơn giản, rẻ tiền.
- Các chu kỳ lên men ngắn ngày.
- Có thể kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của các mẻ lên men.
- Có thể kế hoạch hóa việc thu hoạch enzyme một cách hợp lý phù hợp với các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra (downstream processing).
- Hiệu suất enzyme có thể được tăng lên nhiều lần bằng cách cải thiện các chủng truyền thống và phát triển quá trình lên men, và với việc sử dụng thêm công nghệ di truyền, trong một khoảng thời gian tương đối ngắn có thể cải thiện hiệu suất enzyme lên nhiều lần.
- Các kỹ thuật DNA tái tổ hợp cũng mở ra các cơ hội cho việc sản xuất sinh khối enzyme từ việc nuôi cấy những loài vi sinh vật đòi hỏi điều kiện sinh trưởng khắc khe như: môi trường dinh dưỡng đắt tiền hoặc phải bổ sung các nhân tố cảm ứng (inducers)...
- Các enzyme của các dạng vi sinh vật sống ở điều kiện khắc nghiệt (sinh trưởng ở các điều kiện cực đoan của nhiệt độ, muối, áp lực thẩm thấu, kiềm) nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp nay có thể sinh trưởng thuận lợi trong các nuôi cấy mesophilic (ưa nhiệt trung bình 20-40oC), và có thể sản xuất các enzyme với các đặc điểm chịu nhiệt hoặc chịu muối ở nồng độ cao.
4.1. Lên men E. coli tái tổ hợp
Các enzyme có nguồn gốc từ các sinh vật prokaryote có thể được sản xuất dễ dàng trên quy mô lớn với hiệu suất cao trong các vật chủ E. coli tái tổ hợp. Các quá trình lên men này có thể được tiến hành ở quy mô từ 3.000-6.000 L, và không đòi hỏi các bước cấy gây (inoculum cuture) phức tạp. Một cấu trúc vật chủ thích hợp cho quá trình lên men đặc trưng có thể như sau:
Vật chủ E. coli mang (1) vector plasmid có gen mã hóa cho enzyme cần thiết, (2) cùng với gen chỉ thị kháng kháng sinh thích hợp như ampicillin hoặc neomycin, và (3) một nhân tố cảm ứng như là TAC (bộ ba đặc trưng cảm ứng lactose hoặc isopropylthiogalactose).
Hiệu quả sản xuất cao như mong muốn có thể đạt được bằng cách lên men mẻ có cung cấp dinh dưỡng (fed-batch), trong đó môi trường nuôi cấy mẻ chứa các thành phần cho sự sinh trưởng ban đầu của vi khuẩn, ví dụ: glucose 2%, dịch chiết nấm men (yeast extract) 1%, phosphate 1% và các loại muối khác cùng với kháng sinh được chọn. Sau khi sự sinh trưởng ban đầu được thiết lập, các chất dinh dưỡng bổ sung được cung cấp ở các tỷ lệ thích hợp đảm bảo đủ nguồn carbon và nitrogen.
Nguồn carbon thuận lợi là glucose, và nitrogen có thể là một phức hợp tự nhiên (chẳng hạn như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein), sirô ngô, một loại muối ammonium đơn hoặc urea.
Nuôi cấy E. coli trong môi trường có bổ sung các hỗn hợp amino acid cho khả năng sinh trưởng và sản xuất enzyme nhanh hơn, tuy nhiên việc sử dụng các nguồn dinh dưỡng đơn giản hơn (chẳng hạn nguồn nitrogen), mặc dù có thể đòi hỏi thời gian lên men lâu hơn, vẫn có thể tạo ra sự sinh trưởng của tế bào và hiệu suất enzyme cao tương tự.
Sản xuất enzyme được cảm ứng thuận lợi bằng cách bổ sung isopropylthiogalactoside từ 30-300 mg/L, hoặc lactose từ 1-10 g/L. Việc quyết định thời gian và tần số bổ sung chất cảm ứng là rất quan trọng để thu được hiệu suất enzyme cực đại.
Mật độ tối ưu trên 200 của OD600 nm (50 g trọng lượng khô của tế bào/L) và sự biểu hiện enzyme khoảng 10 g/L (30% của protein tổng số) là một kết quả lên men mong muốn. Quá trình lên men thường thực hiện trong hai ngày ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của cơ thể, nghĩa là từ 24-28oC.
4.2. Lên men nấm
Các loài nấm vật chủ như Aspergillus và Fusarium, và nấm men hướng methyl5 (Pichia) thích hợp cho sản xuất các enzyme glycosyl hóa từ các nguồn động vật hoặc nấm. DNA của enzyme được hợp nhất trực tiếp trong DNA nhiễm sắc thể cùng với hệ thống promoter.
Các vật chủ tái tổ hợp có thể được lên men trong một kiểu tương tự với các nuôi cấy không tái tổ hợp và lên men mật độ cao của tế bào có thể dễ dàng thu được bằng cách dùng các phương thức của kỹ thuật sinh học truyền thống.
5 Chỉ sử dụng chất dẫn xuất methane như là nguồn carbon và năng lượng chuyển hóa. Các vật chủ Aspergillus hoặc Fusarium có thể được sinh trưởng trên các nguyên liệu thô rẻ tiền như bột đậu tương có bổ sung thêm chất dinh dưỡng là sirô ngô (corn sirup). Nấm men, như Saccharomyces và Pichia, có thể sinh trưởng trên dịch chiết nấm men hoặc các dịch thủy phân protein và sirô ngô.
Quá trình nuôi cấy có thể cho sinh khối tế bào cao bằng cách sử dụng các môi trường đã được xác định đầy đủ có bổ sung xen kẽ thêm một vài chất dinh dưỡng khác. Lên men đặc trưng kéo dài từ 4-8 ngày. Sự biểu hiện enzyme vượt quá 10 g/L đã thu được ở quy mô công nghiệp.
4.3. Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật
Một số enzyme công nghiệp vẫn được chiết từ các nguồn động vật như bò tiềm ẩn nguy hiểm của sự nhiễm bẩn bệnh não dạng xốp của bò (bovine spongiorm encephalopathy). Chẳng hạn renin, sau khi thu từ dạ dày của bê con mới sinh sẽ được sử dụng để làm phomát. Nó vẫn không được đảm bảo liệu có hiện diện bất kỳ rủi ro nào cho sức khoẻ của người tiêu dùng hay không, tuy nhiên, renin tái tổ hợp của bê con hiện nay có thể được sản xuất nhờ lên men vi sinh vật là hoàn toàn an toàn.
Một cách khác, bằng phương thức tách chiết enzyme truyền thống từ các nguồn vi sinh vật và việc sử dụng kỹ thuật sàng lọc thích hợp, nhiều enzyme mới giống như enzyme thực vật và động vật hiện nay đã được sản xuất. Ví dụ:
- Enzyme protease của Mucor trong nhiều trường hợp đã thay thế renin từ dạ dày của bê.
- Protease của Aspergillus và Bacillus đã thay thế các enzyme dùng trong thuộc da.
- Rất nhiều loại amylase vi sinh vật được phát triển để thay thế hoặc bổ sung cho các amylase thực vật trong tạo malt của lúa mạch hoặc lúa mì.
- Hơn nữa, một số enzyme có nguồn gốc động vật (như hoạt tố plasminogen của mô) cũng được sản xuất trong các vi sinh vật chủ tái tổ hợp và có thể cung cấp chuỗi protein được tái cuộn xoắn. Các enzyme glycosyl hóa của động vật có vú có thể được biểu hiện trong các cơ thể eukaryote như Saccharomyces và Aspergillus. Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzyme để cung cấp hoạt tính đầy đủ cho dù các đường glycosyl hóa ở đây có thể khác ở động vật có vú.
Các enzyme có thể được sản xuất trực tiếp bằng nuôi cấy tế bào động vật có vú, tuy nhiên giá thành sẽ rất cao khoảng từ 1.000-5.000 USD/gram, một mức giá chỉ có thể chấp nhận cho việc sản xuất các enzyme trị liệu đặc biệt như hoạt tố plasminogen của mô hoặc các protein liên quan.
5. Các nguyên tắc hóa sinh cơ bản
Hiệu suất lên men enzyme vi sinh vật có thể được cải thiện bằng các kỹ thuật kinh điển, tương tự các kỹ thuật dùng để cải thiện hiệu suất trong lên men kháng sinh. Cả hai sự cải thiện di truyền và quá trình lên men đã dẫn đến sự phát triển của khả năng lên men trong sản xuất protein enzyme lên tới 20 kg/m3. Sự hiểu biết về điều hòa di truyền của quá trình tổng hợp protein là rất quan trọng trong chọn lọc các chủng được cải thiện và tối ưu các quá trình lên men. Có nhiều nhân tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến sản xuất enzyme như sau:
5.1. Sự cảm ứng
Sự tổng hợp enzyme thường bị ức chế (điều kiện để giúp bảo tồn năng lượng từ sự tổng hợp protein không cần thiết) tức là enzyme sẽ chỉ được sản xuất trong sự hiện diện của một chất cảm ứng, thường là cơ chất của nó. Mức độ cảm ứng (induction level) có thể là rất mạnh (tăng lên hơn 1.000 lần so với không cảm ứng) và hoạt động bằng cách gây cản trở sự điều hòa nhân tố ức chế. Nhiều enzyme dị hóa có thể được cảm ứng, như:
- Sucrose cần thiết cho sản xuất invertase6.
- Tinh bột cho sản xuất amylase7.
6 Invertase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các disaccharide thành các monosaccharide, đặc biệt thủy phân saccharose thành dextrose và levulose.
7 Amylase là enzyme xúc tác thủy phân các loại carbohydrate dự trữ như tinh bột trong thức ăn thực vật hay glycogen trong thức ăn động vật.
- Galactoside cho sản xuất β-galactosidase.
Trong một số trường hợp, một sản phẩm hoặc một sản phẩm trung gian cũng có thể hoạt động như một chất cảm ứng, ví dụ:
- Phenylacetate cảm ứng penicillin G amidase.
- Các acid béo cảm ứng lipase.
- Xylobiose cảm ứng các xylanase.
Sự cảm ứng sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tổng hợp các enzyme ngoại bào cần thiết cho việc thủy phân các polymer có trọng lượng phân tử lớn để chúng có thể đi vào tế bào và tiếp tục gây ra sự cảm ứng.
Các coenzyme8 cũng có thể hoạt động như các chất cảm ứng, ví dụ: thiamine cảm ứng pyruvate decarboxylase. Hơn nữa, để có hiệu quả trong sản xuất enzyme, sự cảm ứng là điều kiện cần thiết để quyết định hợp lý thời gian sản xuất enzyme trong hệ lên men đảm bảo thu được lượng sản phẩm cao nhất.
Tuy nhiên, trong thực tế sự cảm ứng thường được tiến hành bằng hỗn hợp các tác nhân cảm ứng đắt tiền, được khử trùng và bổ sung ở các thời gian đặc biệt để thiết lập sự lên men. Để khắc phục các vấn đề này các đột biến điều hòa có thể được sản xuất để không phụ thuộc nhân tố cảm ứng và vì vậy được gọi là các đột biến cấu thành.
5.2. Ức chế ngược
- Ức chế ngược (feedback repression) là tác dụng ức chế bằng cách cố định tác động dị lập thể của một chất lên hoạt tính của ít nhất một trong những enzyme xúc tác các bước chuyển hóa dẫn đến sinh tổng hợp riêng của chất đó.
- Tổng hợp enzyme cũng được điều chỉnh bởi sự ức chế ngược xuất hiện ở các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các chất có phân tử lượng thấp (chẳng hạn là một loại amino acid), trong đó sự tích lũy của sản phẩm cuối cùng có thể gây ức chế sự tổng hợp
8 Một chất hữu cơ thường là một vitamin hay một chất tổng hợp từ vitamin để tác dụng lên một cofactor (một chất phi protein như: Cu, Fe hoặc Zn hay một phân tử hữu cơ) giúp enzyme xúc tác một phản ứng trao đổi chất.
Các enzyme đặc biệt, thông thường là enzyme đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp. - Người ta nhận thấy sản phẩm cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp một chất có khả năng gây ra sự ức chế quá trình tổng hợp của chính nó. Sản phẩm cuối cùng dù được tế bào tổng hợp hay thu nhận từ môi trường bên ngoài, khi ở nồng độ dư thừa so với nhu cầu của cơ thể vi sinh vật sẽ ảnh hưởng đến enzyme đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp.
Enzyme đầu tiên (a) là một enzyme dị lập thể. Nó có đặc điểm thay đổi cấu hình không gian khi có mặt sản phẩm cuối cùng nhằm giảm bớt hoạt tính xúc tác của mình. Ở enzyme này, ngoài vị trí gắn với cơ chất A (trung tâm xúc tác), nó còn có một hay nhiều vị trí gắn với sản phẩm cuối cùng X gọi là trung tâm dị lập thể. Trung tâm xúc tác và trung tâm dị lập thể tách biệt nhau về không gian và khác nhau về cấu trúc. Trạng thái hoạt động của enzyme này được đặc trưng ở chỗ nó có khả năng gắn với cơ chất A và nếu bên cạnh cơ chất A còn có sự hiện diện của X ở mức độ dư thừa so với nhu cầu của cơ thể vi sinh vật, thì sẽ xảy ra sự bao vây của trung tâm dị lập thể, làm cho trung tâm xúc tác bị biến đổi cấu hình không gian đến mức khiến cho enzyme (a) không thể gắn được với cơ chất A mà chỉ gắn với X. Như vậy enzym (a) sẽ không có hiệu lực trong việc chuyển hoá A thành B. Chuỗi tổng hợp X sẽ bị gián đoạn do đó X sẽ bị giảm số lượng. Ví dụ minh họa ức chế ngược đối với tryptophan
Các đột biến ức chế ngược có thể thu được bằng cách chọn lọc các nuôi cấy kháng các độc tố của chất đồng đẳng của sản phẩm. Các dòng tế bào sống sót sẽ mất sự mẫn cảm ngược đối với sản phẩm. Các đột biến tương tự có thể thu được bằng cách phân lập các đột biến khuyết dưỡng (nutritional auxotrophs), các đột biến này không thể tạo ra sản phẩm cuối cùng, mà phụ thuộc vào sự bổ sung hợp chất này từ môi trường bên ngoài để sinh trưởng bình thường. Sự cung cấp chất dinh dưỡng được điều chỉnh này sẽ hạn chế các nồng độ trong nội bào tới mức để sự ức chế ngược xảy ra ít hơn.
5.3. Ức chế dinh dưỡng
Tổng hợp enzyme cũng có thể được được điều chỉnh bằng sự ức chế dinh dưỡng đặc trưng bởi carbon, nitrogen, phosphate hoặc sulphate. Những cơ chế này tồn tại để duy trì sự sản xuất của các enzyme không cần thiết.
Dẫn chứng tốt nhất là sự điều chỉnh nhờ hiện diện của glucose mà trong đó carbohydrate này có thể làm ngừng sản xuất của các enzyme cần thiết cho sự chuyển hóa của các hợp chất liên quan và không liên quan (hiệu ứng glucose). Ức chế glucose là một khái niệm chính trong nuôi cấy sinh khối tế bào ở quy mô lớn (nguyên liệu thô có giá trị kinh tế nhất của quá trình lên men). Sự ức chế dị hóa glucose có thể là rất mạnh và thường kìm hãm hiệu quả của chất cảm ứng. Các nguồn carbon khác như lactate, pyruvate, succinate và citrate, cũng là các chất ức chế hiệu quả trong một số vi sinh vật. Thậm chí citrate cũng có thể ức chế sự chuyển hóa của glucose ở một số vi khuẩn.
Sự ức chế dị hóa glucose cũng được giải quyết về mặt di truyền bằng cách chọn lọc các thể đột biến chống lại hiện tượng này. Các đột biến có thể chọn lọc dễ dàng từ môi trường nuôi cấy chứa glucose và cơ chất của enzyme cần thiết, ví dụ: hỗn hợp glucose/aspartate cho phép chọn lọc các dòng sản xuất aspartate không bị ức chế glucose (aspartate được cung cấp ở đây chỉ là nguồn nitrogen). Sản xuất penicillin G amidase trong E. coli được tăng lên nhiều lần bằng cách chọn lọc các đột biến có khả năng sinh trưởng trên amide như là một nguồn nitrogen duy nhất trong sự hiện diện của glucose. Kết quả tạo ra các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất mạnh và không dễ bị ức chế bởi glucose. Sử dụng dạng đồng đẳng của glucose, 2-deoxyglucosse, cũng là một phương thức hiệu quả để chọn lọc các đột biến không có ức chế glucose.
+4NHlà một nguồn nitrogen rất có giá trị. Các muối ammonium là nguồn nitrogen rất rẻ so với các hỗn hợp amino acid, nhưng sự hiện diện của các amino acid thường cho phép vi sinh vật sinh trưởng mạnh và nhanh. Một số đột biến không bị ức chế bởi nguồn nitrogen cũng có thể được chọn lọc dựa trên cơ sở đặc điểm chống chuyển hóa ammonium (sự methyl hóa ammonium-methylammonium).
6. Bất động enzyme
Bất động enzyme (enzyme immobilization) s_ là liên kết giữa một enzyme với một chất mang rắn, đặc trưng là các hạt polymer trong cột hoặc trong lớp nền (bed). Các nguyên liệu bất động đặc trưng có thể là silica hoặc carbohydrate polymer như Sephadex. Bất động enzyme có hai ưu điểm chung:
- Cho phép thu hồi enzyme nhanh và dễ dàng từ hỗn hợp phản ứng, bằng cách tách rời ra khỏi hạt. Điều này thích hợp cho cả hai quá trình tinh sạch hỗn hợp phản ứng và thu hồi enzyme có giá trị.
- Biến đổi các tính chất hóa học của enzyme. Nhiều enzyme ổn định hơn khi liên kết với bề mặt để cố định cấu hình của chúng trong một dạng hoạt động, vì thế sẽ làm chậm các phản ứng khử hoạt tính enzyme.
Sự bất động là rất cần thiết trong các quá trình biến đổi sinh học (biotransformation) công nghiệp. Chẳng hạn, tổng hợp thuốc chống ung thư Camptosar sử dụng enzyme lipase để phân giải thành một chiral9 trung gian: quá trình này chỉ có hiệu quả kinh tế nếu lipase được bất động, tạo cho nó một sự ổn định bổ sung và hiệu quả.
Các enzyme được bất động được sử dụng rất phổ biến trong chế tạo bộ cảm biến sinh học (biosensor) và xét nghiệm sinh học (bioassay). Ở đây mục đích chính là để giữ chúng cố định ở một chỗ để không bị rửa trôi.
Hơn 95% enzyme được bán trong các dạng hòa tan, đa số trong chúng được sử dụng trực tiếp và riêng lẽ, đặc biệt trong công nghiệp bia và công nghiệp thực phẩm. Đối với một số ứng dụng nhất định, cần có enzyme ở dạng bất động sao cho có thể tái sử dụng chúng và dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn hợp phản ứng. Việc dễ dàng loại bỏ sự xúc tác của enzyme đảm bảo thu hồi sản phẩm tốt hơn và giảm thiểu sự lẫn lộn của protein enzyme còn dư trong sản phẩm.
6.1. Các kỹ thuật bất động
9 Chiral: Một vài phân tử có dạng “tay phải” và “tay trái” riêng biệt, mặc dù chúng mang các nguyên tử giống nhau và liên kết trong cùng một kiểu nhưng tính chất vật lý lại khác nhau. Một chất như thế được gọi là hợp chất chiral, và hai (hoặc nhiều) dạng hơn thì mỗi dạng được gọi là chất đối hình (enantiomer) hoặc chất đồng phân quang học (optical isomer).
Có nhiều kỹ thuật để bất động enzyme. Tuy nhiên, việc chọn lựa chính xác tùy thuộc vào ứng dụng cuối cùng của chất xúc tác:
6.1.1. Gắn enzyme lên chất mang bằng phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion.
Nguyên tắc: Hấp phụ enzyme lên các chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein enzyme như lực Van der Waalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzyme sẽ bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp thì enzyme chui vào trong các lỗ xốp của chất mang.
6.1.2. Gắn enzyme bằng liên kết đồng hóa trị
Thường có hai phương pháp:
- Phương pháp 1: Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị. Có hai cách: (1) Gắn một giai đoạn, quá trình kết hợp enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme. (2) Gắn hai giai đoạn, giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng phản ứng hơn, giai đoạn hai là giai đoạn kết hợp enzyme.
- Phương pháp 2: Gắn enzyme với nhau bằng liên kết đồng hóa trị. Nguyên tắc của phương pháp này là liên két chéo đồng hóa trị các phân tử enzyme lại với nhau, tạo thành cấu trúc đại phân tử không tan nhờ các tác nhân lưỡng hoặc da chức mà không càn đến các chất mang.
6.1.3. Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel
Nguyên tắc: Phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới không gian của một polymer không tan trong nước. Gel có thể được điều chế từ các polyacrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate tạo mạng lưới bằng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyuretan, polyvinyl.
Gói enzyme vào trong khuôn gel có bốn phương pháp:
- Phương pháp 1: Enzyme được gói vào trong khuôn gel (ví dụ: alginate) dưới dạng hạt. Enzyme được hòa tan trong dung dịch monomer sau đó monomer này được polymer hóa với sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo mạng lưới (reticulation). Chẳng hạn, Có thể nhỏ giọt dung dịch enzyme + sodium alginate vào dung dịch giàu CaCl2 lúc đó enzyme sẽ được gói trong các hạt calcium alginate.
- Phương pháp 2: Enzyme bị nhốt trong các lố nhỏ của các sợi tổng hợp. Có thể nhốt enzyme vào trong các lỗ nhỏ của sợi tổng hợp bằng cách cho các dòng chất lỏng chảy tuần hoàn bên trong sợi. Hoặc có thể nhốt enzyme trong các mạng lưới collagen. Hoặc dùng enzyme trong dung dịch đệm chứa glycerol và dung dịch nhũ tương của triacetate cellulose trong methylene chloride được đùn ép qua một khuôn có lỗ dưới áp suất nitrogen. Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào bể đông tụ có chứa toluene, sau đó sấy khô sợi trong chân không.
- Phương pháp 3: Gói enzyme trong bao vi thể (microcapsule). Nhốt enzyme trong một bao vi thể giới hạn bởi một màng bán thấm. Màng này có kích thước lỗ xốp đủ nhỏ để ngăn chận sự khuếch tán enzyme ra ngoài nhưng đủ lớn để cho cơ chất và sản phẩm đi qua trong quá trình phản ứng.
- Phương pháp 4: Tạo liên kết chéo giữa các tiền polymer bằng chiếu quang để gói enzyme. Các chất tiền polymer thường dùng là: ENT (metacrylate), PEGM (polyethylene-glycoldimetacrylate), ENTP (tổng hợp từ hydroxyethylacrylate), trong đó PEGM và ENT hòa tan trong nước, còn ENTP không tan trong nước. Khi chiếu tia cực tím gần (360 nm) lên dung dịch có chứa chất tiền polymer + enzyme + chất nhạy quang (benzoin ethylete, benzoin isobutylete) sẽ tạo ra liên kết chéo giữa các gốc của tiền polymer. Từ đó gel được hình thành và bao lấy enzyme.
6.1.4. Cố định enzyme trên tế bào vi sinh vật
Một phương pháp mới có rất nhiều tiềm năng là sử dụng bề mặt vi sinh vật để gắn các chất có hoạt ính sinh học: protein chức năng, enzyme, thụ thể, kháng nguyên, kháng thể và ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: nhận dạng phân tử, cố định enzyme, chữa bẹnh sinh học, biến đổi sinh học, gắn tế bào vào tế bào, sản xuất vaccine. Trong đó, việc nghiên cứu gắn enzyme trên bè mặt tế bào vi sinh vật là một phương pháp mới cũng rất được quan tâm. Chẳng hạn người ta đã cố định amylase, glucoamylase, cellulase trên bề mặt tế bào nấm men, chuyển hóa tinh bột và cellulose thành đường glucose một cách dễ dàng. Hoặc cố định lipase để giúp chuyển hóa dầu thực vật và mỡ tạo năng lượng...
6.2. Các chất mang cho sự bất động
6.2.1. Bất động enzyme bằng hấp phụ hay liên kết ion thường dùng các loại chất mang sau:
- Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin
- Chất mang vô cơ: Silic, thủy tinh xốp, oxide kim loại.
- Chất trao đổi ion: Ambelit, DEAE10-sephadex, CM11-sephadex, DEAE-cellulose, CM-cellulose.
- Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nylon, polyvinyl.
6.2.2. Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị thường dùng các chất mang sau:
- Polymer hữu cơ như: polypeptide, polysaccharide: dextran (sephadex), agarose (sepharose).
- Các dẫn xuất của cellulose: CM-celllulose, DEAE-cellulose, DEAE-sephadex, CM-sephadex.
- Các polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, polyvinyl.
- Các chất vô cơ: silicagel, bentonite, aluminium hydroxide.
6.2.3. Gắn enzyme với nhau bằng liên kết đồng hóa trị thường dùng tác nhân gắn kết là glutaraldehyde
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
Nguyễn Hoàng Lộc