Khả năng ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp (recombinant techniques) hơn 10 năm qua đã có một hiệu quả rất lớn trong sinh sản
10 Diethylaminoethyl cellulose
11 Carboxyl methyl cellulose xuất enzyme vi sinh vật. Vật chủ E. coli thích hợp cho sự biểu hiện cao của enzyme, cung cấp enzyme không bị glycosyl hóa. Các loài Bacillus thích hợp cho sản xuất các enzyme ngoại bào không bị glycosyl hóa. Các loài Aspergillus cũng sản xuất rất nhiều các protein ngoại bào và hơn nữa có thể sản xuất các enzyme được glycosyl hóa.
Một số điểm cần lưu ý khi xây dựng các vi khuẩn/vi nấm tái tổ hợp thích hợp cho sản xuất protein/enzyme quy mô lớn. Đó là:
- Chọn lựa vật chủ là vấn đề then chốt, trong đó vật chủ phải có khả năng sinh trưởng mạnh, không khuyết dưỡng và không có các hệ thống enzyme không mong muốn trong sản phẩm protein/enzyme cuối cùng, chẳng hạn không có hoạt tính β-lactamase trong vật chủ được dùng để sản xuất penicillin G amidase.
- Cấu trúc vector biểu hiện phải càng đơn giản càng tốt. Ví dụ: Hình 6.6 minh họa vector biểu hiện cho gen ngoại lai trong tế bào vật chủ E. coli dưới sự kiểm soát của promoter T7 của bacteriophage.
Sau khi tổng hợp, protein/enzyme tái tổ hợp có thể hoặc tích lũy trong tế bào chất (cytoplasm) hoặc được chuyển tới chất gian bào (periplasm). Sản xuất dư thừa protein ngoại lai này trong cytoplasm thỉnh thoảng có thể tạo ra các thể vùi (thường chứa protein tái tổ hợp trong trạng thái không cuộn xoắn, hoặc xử lý bị hỏng). Kết quả này thường không được mong muốn vì nó gây nhiều khó khăn (dường như là không có khả năng) để tách chiết và tái cuộn xoắn các protein này.
Quá trình tách chiết từ các thể vùi chỉ có giá trị kinh tế khi sản xuất các protein và enzyme có giá trị cao như insulin và hoạt tố plasminogen mô. Kết quả thường được mong muốn hơn là protein được vận chuyển vào trong chất gian bào. Để hiện tượng này xuất hiện cần thiết phải có các chuỗi tín hiệu. Những chuỗi này được định vị ở đầu tận cùng amino của enzyme (vùng ngược hướng-upstream) và có thể được chuyển đi dễ dàng nhờ các peptidase tín hiệu. Ở một số trường hợp nhất định, sự tiết protein vào môi trường ngoại bào trong nuôi cấy E. coli bị giới hạn. Trong trường hợp sản xuất các enzyme ngoại bào, thì Bacillus spp., nấm men và Aspergillus spp. là các vật chủ thích hợp được chọn. Các plasmid phải hiện diện một số lượng bản sao nhiều trong vật chủ và, để làm điều này, cần phải có một số áp lực chọn lọc vì một tế bào vật chủ không có plasmid sẽ phát triển nhanh hơn vật chủ có plasmid. Phương thức thích hợp nhất để chắc chắn có sự biến nạp plasmid vào tế bào vật chủ là thiết kế một gen kháng kháng sinh trên plasmid và sự hiện diện của kháng sinh thích hợp trong môi trường sinh trưởng. Các hệ thống thường được sử dụng là kanamycin phosphotransferase, ampicillin β-lactamase, và chloramphenicol acetyltransferase. Nồng độ kháng sinh trên 30 mg/L đủ để duy trì sự hiện diện của plasmid. Nói chung, sự biểu hiện của các enzyme tái tổ hợp trong nấm (như A. niger) đòi hỏi có sự hợp nhất của gen và promoter của nấm cùng với một cơ chế chọn lọc phối hợp trực tiếp (kháng kháng sinh hoặc một gen dạng hoang dại khắc phục được nhân tố khuyết dưỡng của vật chủ) vào trong DNA nhiễm sắc thể.
- Các promoter cơ bản, như phosphoglycerate kinase và glyceraldehyde phosphate dehydrogenase có tác động rất mạnh và thường được chọn lựa. Các gen promoter được chèn vào ngược hướng với gen enzyme mong muốn để tối ưu hóa sản phẩm. Chẳng hạn như promoter tinh bột có thể được dùng như là một tín hiệu thích hợp cho sản xuất α-amylase, hoặc promoter phenoxyacetic acid có thể được dùng để sản xuất penicillin V amidase. Thông thường chất cảm ứng hoạt hóa promoter không liên quan đến enzyme, ví dụ: methanol được dùng để kích thích promoter alcohol dehydrogenase trong Pichia, là loại có thể được kết hợp với nhiều gen enzyme khác nhau.
- Chất cảm ứng được chọn phải được duy trì trên một nồng độ tới hạn, tuy nhiên việc quyết định thời gian bổ sung chất cảm ứng không phải là vấn đề then chốt.
1. Phát sinh đột biến điểm định hướng
Các protein/enzyme đã biết trình tự amino acid và cấu trúc ba chiều có thể được biến đổi bằng đột biến điểm định hướng. Vị trí hoạt động của amino acid hoặc các vùng quan trọng khác được coi là mục tiêu để thay đổi thành các amino acid khác. Điều này được thực hiện dễ dàng bằng cách thay đổi các mã bộ ba đặc trưng trong gen Nhập môn Công nghệ sinh học 223
mã hóa protein/enzyme và biểu hiện protein/enzyme được phân tích bằng phương pháp tạo dòng truyền thống.
. Sự biểu hiện của của các gen đích được tạo dòng trong vector được cảm ứng bằng cách cung cấp một nguồn T7 DNA polymerase trong tế bào vật chủ E. coli (chủng BL21(DE)3pLysS) có chứa một bản sao trong nhiễm sắc thể của gen T7 DNA polymerase. Gen T7 DNA polymerase chịu sự kiểm soát của promoter lacUV5 được cảm ứng bằng IPTG. Gen T7 DNA polymerase được biểu hiện nhờ sự cảm ứng và nó biến đổi hầu như tất cả tế bào vật chủ để phiên mã gen quan tâm. PT7-promoter T7, RBS-vị trí liên kết ribosome, ATG-mã khởi đầu, 6xHis (N-terminal polyhistidine) dùng cho tinh sạch nhanh bằng ProBond® resin, N-terminal Xpress® epitope dùng cho phát hiện protein bằng Anti-Xpress® Antibody, EK- vị trí cắt Enterokinase để loại bỏ vòng dung hợp, MCS-vùng tạo dòng, Stop-gen kết thúc phiên mã terminator, f1 origin-giải phóng ssDNA cho phép phân tích trình tự dễ dàng và phát sinh đột biến (mutagenesis), Ampicillin-gen chọn lọc kháng kháng sinh. A, B, C-là một bộ gồm 3 loại vector (A, B và C). Mỗi loại có một trình tự mã hóa N-terminal trong một khung đọc khác nhau liên quan với vị trí tạo dòng MCS để đơn giản hóa trong khung dòng gen cần chèn vào. Các protein/enzyme mới dễ dàng sản xuất bằng cách dùng các phương thức sản xuất giống như đã được phát triển cho các dạng tự nhiên, vì thay đổi các amino acid này không ảnh hưởng lên sinh trưởng của vật chủ hoặc sự biểu hiện protein. Những thay đổi amino acid như thế đã được tăng lên một cách ổn định.
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
Nguyễn Hoàng Lộc