Hotline

Công nghệ PROTEIN

Chủ biểu hiện thích hợp, vì một protein được sửa đổi sẽ không thể biểu hiện trong cùng một kiểu như trình tự của bố mẹ
chủ biểu hiện thích hợp, vì một protein được sửa đổi sẽ không thể biểu hiện trong cùng một kiểu như trình tự của bố mẹ (thỉnh thoảng là tốt hơn, nhưng thường là không). Các nhân tố này đang trở thành quan trọng hơn khi nhiều phương thức dựa vào các hệ thống thể hiện thư viện, trong đó các thành viên của thư viện có thể bị mất hoặc không được miêu tả đúng mức do biểu hiện kém hoặc do cuộn xoắn không đúng. Đã có rất nhiều thử nghiệm để cải thiện sự biểu hiện và điều chỉnh sự cuộn xoắn protein của các hệ thống vật chủ, đặc biệt là E. coli. Để khắc phục một số vấn đề này, các hệ thống phiên mã-dịch mã in vitro cũng đã được sử dụng và đang được tối ưu hóa cho sản xuất quy mô nhỏ một cách hiệu quả các protein mới Công nghệ protein là quá trình xây dựng các phân tử protein mới, bằng cách thiết kế một phân tử protein dựa trên các nguyên lý cơ bản nhất, hoặc sửa đổi cấu trúc của một protein đang có, nhằm mục đích:
- Nghiên cứu quá trình lắp ráp của các protein và các nhân tố của chuỗi sơ cấp tham gia vào sự cuộn xoắn, ổn định và thể hiện chức năng của chúng. Các đặc điểm này có thể được khảo sát bằng cách sửa đổi một hoặc nhiều amino acid đặc trưng theo một kiểu đã được định hướng trong protein và quan sát kết quả sau khi sản xuất phiên bản đã được sửa đổi. Thông thường các protein có trình tự tương tự không giống nhau hoàn toàn, tồn tại trong tự nhiên sẽ có các tính chất hơi khác nhau và người ta có thể dựa vào các trình tự khác nhau này để tiến hành những sửa đổi sau đó.
- Sản xuất các phân tử protein ổn định cho một mục đích công nghệ đặc biệt, tuy nhiên các phiên bản được tìm thấy trong tự nhiên không có các tính chất tối ưu cần thiết. Ví dụ: một enzyme có thể được xem như một phần của một quá trình công nghiệp nhưng một điểm đặc trưng của protein, chẳng hạn độ ổn định nhiệt hoặc là độ pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác… không thể tương thích với quá trình đó. Các thay đổi amino acid có thể biến đổi enzyme này sao cho nó thực hiện chức năng tốt hơn trong môi trường mới. Có nhiều minh họa khác về protein được sửa đổi để giúp cho chúng phù hợp tốt hơn với các hoạt động công nghệ và thương mại và một số trong đó được trình bày ở mục 3 (Các ứng dụng). 
Muốn công nghệ hóa một protein cần phải hiểu biết về các nguyên lý cấu trúc của protein đó và đặc điểm của nguyên liệu để thiết kế hợp lý, hoặc sửa đổi các tính chất mong muốn. Hơn nữa, công nghệ này phải có được các công cụ sản xuất và phân tích protein mong muốn. Các công cụ và nguyên lý cơ bản hiện nay đang được phát triển song song.
Các phần dưới đây cung cấp những kiến thức cơ bản của công nghệ protein và tóm tắt một vài phát triển của lĩnh vực này trong thời gian gần đây.
1. Cấu trúc protein
Các nghiên cứu về các cấu trúc của protein đã cho thấy có thể phân biệt cấu trúc của phân tử protein thành 4 bậc như sau: Cấu trúc bậc một (cấu trúc sơ cấp) là trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ các liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị). Cấu trúc bậc hai (cấu trúc thứ cấp) là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong chuỗi polypeptide, hay nói cách khác đó là dạng cuộn xoắn cục bộ (local fold) của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết hydro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định. Cấu trúc bậc ba là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng cuộn xoắn trong không gian của toàn chuỗi polypeptide (overall fold), đây là hình dạng chung của chuỗi polypeptide. Các liên kết như liên kết Vandervan, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của các gốc amino acid đều tham gia giữ vững cấu trúc bậc ba. Cấu trúc bậc bốn xuất hiện ở những phân tử protein bao gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu (bậc ba), tương tác không gian (sự sắp xếp) giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu trúc bậc bốn. Mỗi chuỗi polypeptide này được gọi là một tiểu đơn vị (subunit). Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, lực Vandervan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị. Tuy nhiên, đến nay nhiều vấn đề cơ bản về các tính chất của protein vẫn chưa được giải quyết, ví dụ cơ chế cuộn xoắn protein vẫn còn là chủ đề của một số cuộc tranh luận.
Phần tiếp theo dưới đây sẽ mô tả các công cụ cơ bản của công nghệ protein và một loạt các ví dụ thành công trong lĩnh vực này.
2. Các công cụ
2.1. Nhận dạng trình tự
Hiện nay, nhận dạng trình tự (sequence identification), bằng phân tích trình tự gen hoặc protein là một quá trình tương đối không khó khăn. Các cơ sở dữ liệu lớn hiện có chứa nhiều ngàn trình tự khác nhau. Hơn nữa, các dự án phân tích trình tự genome đang cung cấp các trình tự mới và các khung đọc mở (open reading frame) với một tốc độ tăng lên liên tục. Các chức năng của nhiều trình tự này đã được biết, từ các dữ liệu di truyền hoặc hóa sinh, hoặc bằng sự tương đồng trình tự đối với các trình tự chưa biết khác. Điều này đã giúp cho công nghệ protein một phương pháp tiếp cận với sự thiết kế hợp lý.
2.2. Xác định cấu trúc và mô hình hóa
Các thông số về cấu trúc có độ phân giải cao, được xác định bằng tia X hoặc tinh thể học điện tử (electron crystallography) hoặc kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance-NMR), là điểm cốt lõi của sự hiểu biết về hóa sinh protein. Số lượng protein mà cấu trúc có độ phân giải cao đang tăng nhanh, nhưng vẫn còn một số lớn các trình tự đã được xác định là chưa biết. Trong lúc chờ đợi làm đầy lỗ trống trong cơ sở dữ liệu cấu trúc, khi cơ sở dữ liệu về cấu trúc toàn diện này đang được lắp ráp, thì những cố gắng khác vẫn đang được tiến hành bằng nhiều phương thức để dự báo các cấu trúc của protein.
Dự báo các cấu trúc protein từ trình tự sơ cấp (cấu trúc bậc một) có một lịch sử lâu dài và được thực hiện bằng cách mô hình hóa các trình tự mới dựa trên các cấu trúc đã biết của các trình tự tương đồng hoặc các tiểu trình tự (sub-sequence), hoặc ở đó có ít sự tương đồng với các trình tự đã biết, bằng cách dùng các kỹ thuật “xâu kim thành chuỗi” (threading) hoặc nhận biết sự cuộn xoắn, trong đó một trình tự mới được so sánh trực tiếp với các kiểu cấu trúc đã biết.
2.3. Biến đổi trình tự
Biến đổi một protein đang tồn tại bằng cách sửa đổi trình tự gen, từ các phạm vi hoàn chỉnh cho đến các amino acid đơn, hiện nay là một quá trình thông thường và lĩnh vực này bây giờ là phần ít khó khăn nhất của quá trình công nghệ. Từ đầu 1980, các phương pháp biến đổi trực tiếp protein bằng phát sinh đột biến đặc trưng điểm định hướng oligonucleotide (oligonucleotide-directed site specific), bằng tổng hợp gen hoàn chỉnh từ các oligonucleotide, và bằng cách dùng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã trở nên thông dụng.
Các phương pháp này bị hạn chế đối với các amino acid được mã hóa bởi gen. Nhiều trình tự cũng có thể được tạo ra bằng cách tổng hợp protein theo phương pháp hóa học trong điều kiện in vitro, phương pháp này cũng cho phép hợp nhất các amino acid không được mã hóa trong chuỗi protein.
2.3.1. Các phương pháp phát sinh đột biến điểm định hướng
Có hai phương pháp cơ bản để sửa đổi một trình tự mã hóa đang tồn tại của protein ở mức độ DNA. Cả hai phương pháp đòi hỏi gắn mồi (ủ) một hoặc nhiều oligonucleotide (ít nhất là tạm thời) trên DNA sợi đơn (single strand DNA, ssDNA), sau đó hoạt tính DNA polymerase in vitro sẽ xúc tác để mở rộng các oligonucleotide. Hai phương pháp đó là:
a. Phương pháp không dùng PCR
Ở các phương pháp không dùng PCR, trình tự DNA được biến đổi liên kết với gốc tái bản (ví dụ: plasmid, bacteriophage hoặc phagemid), cho phép khuếch đại in vivo các kiểu gen đã được biến đổi hoặc của bố mẹ. Một oligonucleotide tổng hợp mang đột biến cần thiết được gắn với khuôn mẫu ssDNA mạch vòng (ví dụ: genome của phage có ssDNA như M13 hoặc ФX174 hoặc dạng ssDNA của phagemid (Hình 6.1a) hoặc với một khuôn mẫu dsDNA đã được sợi đơn hóa từng phần (Hình 6.1b). Nhiều phương pháp enzyme khác nhau có thể tạo ra khuôn mẫu ssDNA từng phần.
Các oligonuleotide được ủ hoạt động như một primer cho sự tổng hợp in vitro DNA bằng cách dùng DNA polymerase, thường DNA polymerase T4 hoặc T7, và với sự hiện diện của DNA ligase, các phân tử DNA sợi đôi mạch vòng đóng (dsDNA) sẽ được tạo ra (Hình 6.1c). DNA sợi đôi được đưa vào trong các tế bào vật chủ thích hợp để tái bản và phân chia. Sau đó sự biến đổi mong muốn được xác định bằng một trong số phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc.
b. Phương pháp dựa trên PCR
Phương pháp không dùng PCR đã biết kỹ càng và được tối ưu hóa trong nhiều năm. Tuy nhiên, gần đây các phương pháp dựa trên cơ sở PCR được ứng dụng rộng rãi hơn, đặc biệt để tái sắp xếp nhanh các vùng protein nơi mà các vị trí hạn chế phổ biến thường không có sẵn.
Trong các hướng dựa trên cơ sở PCR, sự biến đổi mong muốn đã được tạo ra và khuếch đại in vitro bằng cách ủ DNA đích (target DNA) bị biến tính với một oligonucleotide mang đột biến cần thiết có thể hoạt động như một primer cho việc tái bản của sợi DNA bổ trợ (Hình 6.2).
Có rất nhiều biến thể khác nhau đối với phương pháp dựa trên PCR, một số trong chúng cần các vị trí hạn chế ở các oligonucleotide đột biến. Điều này có thể làm giảm số lượng các phản ứng. Ví dụ: nếu ở hình 6.2, các primer A và D có các vị trí cắt hạn chế hữu ích trong các trình tự và ở vị trí D là 3’ tới trình tự đột biến, thì các sản phẩm phản ứng đầu tiên có thể được tạo dòng trực tiếp sau đó. Đoạn DNA được khuếch đại sẽ liên kết với gốc tái bản của vi khuẩn trong plasmid hoặc phage và được tạo dòng bằng cách xâm nhiễm vào trong vi khuẩn.
Một biến thể của phương thức PCR cho phép liên kết với các trình tự riêng biệt có thể mã hóa cho các vùng từ các protein khác nhau hoặc có thể cho phép tái tổ chức các vùng trong một protein. Trong phương thức này (hình 6.3), các primer C và D là các thể lai chứa các trình tự có thể ủ với cả hai vùng.
Sau đó, các phản ứng đầu tiên tạo ra các đoạn dsDNA nay chồng lấp lên nhau trong chuỗi và sản phẩm mong muốn có thể được tạo ra trong phản ứng thứ ba bằng cách dùng các primer A và B.
Trong tất cả trường hợp, thiết kế các trình tự oligonucleotide và các điều kiện phản ứng cần phải được xem xét cẩn thận cùng với sự chọn lựa chính xác của DNA polymerase ổn nhiệt. Tuy nhiên, các phương thức này là được tiến hành rất nhanh và có hiệu quả rất cao.
2.4. Phát triển phân tử (molecular evolution)
Trong nhiều trường hợp sự biến đổi có định hướng của một trình tự không phải là phương thức thích hợp để thu được kết quả mong muốn, bởi vì thường không xác định được các amino acid đích nằm ở đâu và biến đổi chúng thành cái gì. Một số phương thức khác đã được phát triển để sản xuất và thử nghiệm các thư viện lớn hoặc các tập hợp biến thể (repertoires of variants) của một trình tự đặc biệt.
Các phương thức này thường dựa vào ba đặc điểm chính: Thứ nhất, đó là nucleic acid mã hóa cho trình tự protein quan tâm duy trì sự liên kết vật lý với protein. Sự liên kết này có thể được thực hiện nhờ hiện diện của protein trên bề mặt của bacteriophage, hoặc vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote trong đó trình tự mã hóa nằm trong phage hoặc tế bào, hoặc trên polysome mà ở đó mRNA và protein mới được dịch mã vẫn còn được liên kết bởi ribosome.
Thứ hai, một phương pháp được phát triển để tạo ra một số lớn các biến thể thường bằng cách đưa các đoạn oligonucleotide thoái biến (degenerate oligonucleotide) vào trong trình tự mã hóa bằng cách chèn đoạn cassette hoặc dùng phương thức PCR, hoặc bằng phương pháp phát sinh đột biến in vitro. Tuy nhiên, với các phương thức như thế thì mỗi lần chỉ có một đoạn nhỏ protein được sửa đổi. Các thư viện bị giới hạn bởi khả năng tiếp nhận các thành viên riêng rẽ của tế bào vật chủ, và trong trường hợp này thì 1012-1014 được xem là một số lượng lớn. Thứ ba, các phương pháp này đòi hỏi một phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc sẽ làm phong phú từ trong thư viện các trình tự protein mới có kiểu hình quan tâm. Sàng lọc bao gồm việc gắn vào một phối tử là có thể dễ dàng được thực hiện. Các sàng lọc bao gồm sự xúc tác và cho kết quả các protein hiện diện thu được trên một giá thể rắn. Các hệ thống chọn lọc thường bao gồm bổ sung của một chức năng cần thiết trong cơ thể vật chủ.
Những protein hữu ích đã được phân lập từ các phương thức trên có thể được khuếch đại bằng cách nhân (sinh sản) phage hoặc tế bào vi khuẩn chứa trình tự gen của nó, hoặc bằng cách khuếch đại trực tiếp các trình tự của chính gen bằng PCR để làm giàu trình tự mong muốn. Các phương pháp loại này nhanh chóng trở thành kỹ thuật quan trọng cho công nghệ protein và được gọi bằng thuật ngữ phát triển định hướng (directed evolution).
2.5. Thiết kế trình tự de novo
Thiết kế protein de novo là một công việc rất phức tạp. Về nguyên tắc, đối với một protein bất kỳ có n gốc amino acid thì khả năng sẽ có 2× 10n trình tự khác nhau. Các cơ sở dữ liệu về cấu trúc và trình tự protein cho thấy nhiều trình tự có thể được điều chỉnh sự cuộn xoắn tương tự nhau và chúng có thể thực hiện các chức năng tương tự. Vì thế, phương pháp tiếp cận ngược lại để chọn lựa số lần cuộn xoắn thích hợp và sau đó xác định trình tự nào cần thiết để tạo ra sự cuộn xoắn mong muốn và có chức năng liên quan thích hợp hơn. Dahiyat và Mayo (1997) đã mô tả các phương pháp máy tính để thiết kế các trình tự của vùng peptide. Chỉ khi có trình tự peptide thì protein mới có thể được xây dựng hoặc bằng tổng hợp peptide (nếu trình tự có kích thước vừa phải) hoặc bằng tổng hợp gen. Gần đây, các phương pháp khuếch đại PCR để tổng hợp gen thường được sử dụng nhất, để làm đầy và khuếch đại từng phần các oligonucleotide chồng lấp nhau (overlap extension).
2.6. Biểu hiện
Khi một trình tự mới được xác định cần phải cho nó biểu hiện để chứng minh chức năng của protein. Sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp là một công việc vô cùng phức tạp và các hệ thống biểu hiện vật chủ nằm trong phạm vi từ vi khuẩn (E. coli là vật chủ hiển nhiên nhất), tới nấm men (chẳng hạn Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris) tới các tế bào côn trùng và các nuôi cấy tế bào động vật có vú, tới động-thực vật chuyển gen. Quy mô sản xuất protein cũng thay đổi khác nhau. Ở các giai đoạn đầu của quá trình phát triển một protein mới, ví dụ một phân tử protein được nhận dạng trong một thư viện thể hiện, thì chỉ một lượng nhỏ (μg) của protein là đủ để xác nhận một đặc tính sinh học. Trong giai đoạn hai, cần có một lượng nguyên liệu tinh sạch lớn hơn (từ 10 đến 100 mg) để thu được các thông tin cấu trúc đặc trưng và thực hiện thêm một số thử nghiệm in vitro và in vivo. Trong một vài trường hợp, có thể cần lượng nguyên liệu được tinh sạch lớn hơn (từ vài g đến vài kg) bằng các phương thức nghiêm ngặt (và thường là tốn kém) nếu protein được sản xuất để sử dụng cho các mục đích thương mại (ví dụ các enzyme công nghiệp).
Thông thường, người ta thì phải thử nghiệm một số phương pháp khác nhau để tìm kiếm một vật với các lượng thích hợp cho phân tích.
2.7. Phân tích
Cấn phải có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các đặc điểm của các protein được biến đổi. Khi một chức năng được sửa đổi (đưa vào, biến đổi hoặc loại bỏ) thì một phương pháp thử nghiệm sinh học thích hợp có thể được phát minh để xác định khả năng của protein mới được sản xuất. Trong đó, phải đảm bảo rằng phép thử nghiệm có thể có tiến hành với một lượng rất nhỏ của nguyên liệu, chẳng hạn các nguyên liệu thu được từ phương thức khuếch đại thư viện.
Trong nhiều trường hợp, việc đạt được và chứng minh chức năng mới của protein là quan trọng nhất. Tuy nhiên, có thể thêm vào các phép thử nghiệm chức năng, để giải thích các kết quả thường đòi hỏi một sự hiểu biết đầy đủ cấu trúc được sửa đổi, đặc biệt để thu được sự hiểu biết sâu sắc sau này về sự cuộn xoắn của protein. Việc thừa nhận số lượng hợp lý của protein mới có thể được chuẩn bị, các tính chất thô có thể được phát hiện bởi kính quang phổ (spectroscopic) hoặc các phép đo quy mô lớn khác ví dụ: các tính chất lưỡng hướng sắc vòng (circular dichroism), độ đục (turbidity), ethalpy, độ lắng đọng (sedimentation) hoặc sắc ký (chromatography). Tuy nhiên, thông tin cấu trúc chi tiết về sản phẩm cuối cùng vẫn còn là bước hạn chế trong thiết kế và công nghệ protein hợp lý. Gần đây, kết quả của Casimiro và cs (1997) đã cho thấy sự tổng hợp gen dựa trên cơ sở PCR, biểu hiện trong E. coli của các lượng mg của protein được đánh dấu đồng vị phóng xạ và phổ NMR có thể được thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn hợp lý.
3. Các ứng dụng
3.1. Các đột biến điểm
Các đột biến điểm riêng rẽ trong các protein có thể thu được chỉ khi trình tự gen là thuận lợi, bằng cách dùng các kỹ thuật đã được trình bày trước đây. Một vài ví dụ được đưa ra dưới đây.
3.1.1. Betaseron/Betaferon (Interferon β-1b)
Một trong những ví dụ đầu tiên của công nghệ protein dược học là sản xuất interferon β-1b. Protein mới này được tạo ra bởi sự thay thế của cysteine (Cys) cho serine (Ser) ở gốc 17 của phân tử interferon β dài 154 amino acid. Sự thay thế này làm giảm khả năng tạo thành cầu nối disulphide không chính xác trong suốt sự tổng hợp ở E. coli, và cũng loại bỏ một vị trí có khả năng cho sự oxy hóa ở hậu dịch mã. Protein có được được biểu hiện trong E. coli ở một hoạt tính đặc trưng gần với interferon β tự nhiên có nguồn gốc từ fibroblast. Phân tử đã được đăng ký bản quyền từ 1993 cho việc sử dụng để làm giảm tần số và mức độ khốc liệt của tái phát ở những bệnh nhân đi lại được có sự tái phát yếu bệnh đa xơ cứng.
3.1.2. Humalog (Lispro Insulin)
Humalog là một dạng biến đổi gen của insulin người trong đó hai gốc ở C-terminus của chuỗi B, proline (Pro) và lysine (Lys) ở các gốc 28 và 29, tương ứng, được đảo ngược trong thứ tự của chúng. Humalog là một dạng đồng đẳng hoạt động nhanh của insulin, được thiết kế để bắt chước tốc độ tự nhiên của đáp ứng insulin tự nhiên của cơ thể đối với thực phẩm. Sự biến đổi C-terminus được thiết kế dựa trên cơ sở cấu trúc và sự tương đồng trình tự đối với nhân tố sinh trưởng 1 giống insulin (insulin-like growth factor 1-IGF-1) và sự đảo ngược trình tự làm giảm sự nhị trùng hóa (dimerization) của tiểu đơn vị B. Điều này làm giảm phương thức tự phối hợp cái mà monomer là sẵn sàng thích hợp hơn cho chức năng sau khi thực phẩm được đưa vào và vì thế có thể được quản lý rất ngắn trước các bữa ăn. Humalog đã được đăng ký bản quyền sử dụng trước 1996.
3.1.3. Các tá dược vaccine mới (adjuvants)
Vaccine cho tới gần đây là một trong nhiều thành công nhưng lại là loại dược phẩm bị đánh giá thấp. Tuy nhiên, gần đây, các phương pháp tiếp cận mới cho thiết kế vaccine đã đưa lĩnh vực y học này lên hàng đầu. Các vaccine hiện nay là loại sản phẩm công nghệ sinh học chính trong sự phát triển. Công nghệ protein đang được dùng để xây dựng các phân tử protein mới cung cấp sự hỗ trợ miễn dịch (adjuvant) để kích thích một phản ứng miễn dịch tới một kháng nguyên đồng quản lý (co-administered antigen). Các tá dược protein mới này là sự quan tâm đặc biệt đối với việc kích thích các phản ứng miễn dịch mucosal sau khi chủng ngừa bằng cách uống (oral immunization) để tránh việc sử dụng tiêm phòng vaccine (injection for vaccination). Hầu hết những vaccine loại này đã được khảo sát tốt là độc tố Vibrio cholerae (CT) và độc tố không bền nhiệt của E. coli (LT). Các cấu trúc tinh thể của LT và CT đã được hòa tan. Các thí nghiệm phát sinh đột biến định hướng điểm dựa trên cấu trúc LT đã dẫn đến một sự hiểu biết về mối quan hệ của tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme đơn đến 5 tiểu đơn vị B của các độc tố heterohexameric này, sự định vị của các vị trí liên kết enzyme và cofactor trong tiểu đơn vị A, và của các điểm cắt hoạt tính trong tiểu đơn vị A. Các thí nghiệm này đã dẫn dắt tới việc xây dựng các độc tố đột biến là cái vẫn còn ổn định để lắp ráp trong holotoxin, nhưng cái đó có độc tính in vitro tối thiểu trong khi giữ lại các đặc tính miễn dịch và tá dược của chúng. Ví dụ, đột biến Ser tới Lys ở gốc 63 trong tiểu phần A của LT ức chế sự liên kết với độc tính của NAD cofactor cho hoạt tính ADP ribosyltransferase. Đột biến S63K này cho thấy cường độ độc tính giảm 6 lần trong khi các đặc tính vẫn duy trì các khả năng miễn dịch và tá dược. Như một sự lựa chọn, đột biến ở gốc 192 (Arginine (Arg) thành glycine (Gly)) trong tiểu đơn vị A của LT đã được thực hiện. Đột biến này là ở điểm trong đó tiểu vùng A1 bị phân giải từ tiểu vùng A2 và nó là bước đầu tiên trong hoạt động của chức năng enzyme của tiểu đơn vị A. Đột biến cũng dẫn đến độc tố bất hoạt enzyme là cái duy trì các đặc tính tá dược. Các độc tố đột biến này hiện nay đang được thử nghiệm trong các nghiên cứu lý thuyết và lâm sàng để đánh giá lợi ích của chúng.
3.2. Sắp xếp lại vùng (liên kết, trao đổi và xóa bỏ)
Hầu hết các protein lớn bao gồm các vùng cuộn xoắn độc lập nhỏ hơn. Các vùng này thường được liên kết cùng với các chuỗi peptide ngắn và trong nhiều, nhưng không phải tất cả, trường hợp thì các vùng này có thể xác định như là các exon phân chia trong trình tự gen. Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta có khả năng bổ sung, loại bỏ hoặc trao đổi các vùng từ một protein này tới protein khác để tái xây dựng các phân tử protein.
3.2.1. Các vùng liên kết
a. Các dung hợp vùng cho đích tế bào
Trong số các minh họa đầu tiên của công nghệ protein đó là vùng có vị trí liên kết của kháng thể được liên kết di truyền với enzyme. Đơn vị kháng thể cơ bản là một cấu trúc có dạng Y hoặc T bao gồm hai chuỗi nặng xác định 50 kDa và hai chuỗi nhẹ xác định 25 kDa, vùng liên kết kháng nguyên được biết là vùng Fab, được bao gồm một nữa đầu N-terminus của một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ. Đầu C-terminus chia đôi hai chuỗi nặng cùng phối hợp để tạo thành vùng Fc. Vùng sau này được đòi hỏi phải có sự tương tác với các tế bào khác nhau của hệ thống miễn dịch và với bổ thể, và cũng là quan trọng trong việc xác định chu kỳ nữa phân rã (half-life) huyết thanh của các kháng thể, ít nhất là loại IgG.
Các dung hợp gen enzyme-kháng thể được thực hiện bằng cách lấy trình tự DNA mã hóa cho thành phần chuỗi nặng của Fab của kháng thể và liên kết cái này hoặc với các chuỗi mã hóa cho nulease của khuẩn tụ cầu hoặc DNA polymerase của E. coli. Đưa các gen dung hợp này vào tế bào sản xuất chuỗi nhẹ của kháng thể, và biểu hiện của gen dung hợp, tái thiết lập cả hai hoạt tính enzyme và liên kết kháng nguyên. Các ví dụ dầu tiên cho những cái này cung cấp cơ sở cho các ví dụ khác trong đó một chức năng liên kết (kháng thể, cytokine, nhân tố sinh trưởng hoặc vùng liên kết phối tử ngoại bào (ECD) của thụ thể) được liên kết với một chức năng của cơ quan phản ứng lại kích thích (độc tố, enzyme, cytokine). Một vùng liên kết không phải kháng thể (non-antibody) có thể được gắn với vùng Fc của một kháng thể để lấy ưu điểm của chu kỳ bán phân rã dài của huyết thanh của các kháng thể để cải thiện các đặc tính của đông học dược phẩm (pharmacokinetic) của một phân tử được thiết kế.
Chẳng hạn, EnbrelTM (etanercept) gần đây đã được đăng ký bả quyền sử dụng cho người. EnbrelTM chứa các vùng ngoại bào của thụ thể đối với nhân tố α gây hoại tử khối u của cytokine (TNFα) được dung hợp di truyền với các vùng Fc của IgG và được dùng để ngăn chận hoạt tính của TNFα. EnbrelTM hiện nay đã đăng ký bản quyền cho việc làm giảm các dấu hiệu và triệu chúng của bệnh viêm khớp từ vừa phải đến khốc liệt ở các bệnh nhân có các phản ứng không đầy đủ đối với một hoặc nhiều loại thuốc chống viêm khớp làm giảm nhẹ bệnh.
b. Các cytokine được dung hợp
Các cytokine khác nhau thường có các chức năng chồng lấp, hoặc có thể hoạt động hợp lực trên cùng tế bào để gây ra một thay đổi sinh lý đối với tế bào. Liên kết các cytokine bằng cách dung hợp các gen trong khung (in-frame) buộc hai nhóm chức năng cùng với nhau và có thể về nguyên tắc dẫn đến hiệu quả sinh học mong muốn ở các liều thấp hơn nếu được thực hiện riêng rẽ. Các dung hợp của loại này đã được công bố cho các interferon cách đây hơn một thập kỷ. Gần đây hơn PIXY321, một dạng dung hợp của GM-CSF và IL-3 đã được mô tả. Trong trường hợp này, các gen GM-CSF và IL-3 được sửa đổi để loại bỏ các vị trí N-glycosylation của động vật có vú và sau đó được liên kết bằng cách bổ sung một nhân tố liên kết gồm 15 amino acid linh hoạt giữa C-terminus của GM-CSF và N-terminus của IL-3. Nấm men biểu hiện PIXY321 cho thấy ái lực thụ thể được tăng cường, hoạt tính sinh sản và hoạt tính kích thích tạo khuẩn lạc được so sánh với một trong số các protein khởi đầu monomeric.
3.2.2. Trao đổi các vùng protein
Một phương thức đơn giản khác được dùng trong công nghệ protein là trao đổi các vùng hoàn chỉnh, trong đó các vùng tương tự từ các nguồn khác nhau đã được trao đổi trong một protein đa vùng để cung cấp một chức năng mới.
a. Các kháng thể khảm người-chuột
Ở đây các vùng liên kết kháng nguyên từ kháng thể đơn dòng của chuột được liên kết với các vùng không đổi (cái cung cấp các chức năng phản ứng lại kích thích miễn dịch và sai khiến half-life sinh học) từ một kháng thể người. Sự chuyển mạch này có thể làm giảm rõ rệt sự sinh kháng nguyên (immunogenicity) không mong muốn so với kháng thể chuột gốc. Tới nay có 4 sản phẩm kháng thể khảm đã được đăng ký bản quyền như là các dược phẩm, bao gồm phức hợp chống tiểu huyết cầu (anti-platelet) ReoProTM.
b. Xoá các vùng
Hoạt tố plasminogen mô (tPA) là một serine protease chiết từ các tế bào màng trong. Tiếp theo liên kết với fibrin tPA hoạt hóa plasminogen thành plasmin là cái sau đó khởi đầu phân giải huyết khối cục bộ (local thrombolysis). Reteplase là một dạng biến thể trong đó 3 trong 5 vùng của tPA đã bị xóa. Một trong các vùng có khả năng chọn lọc fibrin, và vùng xúc tác được giữ lại. Reteplase được đăng ký bản quyền như là Retavase cho việc điều trị chứng nhồi máu cơ tim cấp tính để cải thiện dòng chảy của máu (blood flow) trong tim.
3.3. Sắp xếp lại protein hoàn chỉnh
Nhiều protein tồn tại như là các họ nhiều thành viên trong đó những protein tương đồng thể hiện các hoạt tính sinh học hơi khác nhau được xác định bởi sự biến đổi trình tự. Trong những bước đầu tiên của công nghệ protein, các gen lai được tạo ra bằng cách trao đổi trình tự ở các vị trí cắt hạn chế phổ biến, hoặc bằng sự tái tổ hợp in vivo giữa các gen tương đồng trong một kiểu ngẫu nhiên hơn. Các phương pháp này sản xuất một số nhỏ các gen mới có thể được kiểm tra riêng rẽ. Gần đây hơn, các dạng tương đồng của protein đã được sử dụng để tạo ra các thư viện rất lớn của các biến thể mới bằng cách sắp xếp trình tự. Trong phương thức này, các gen cho 2 hoặc nhiều thành viên hơn của họ được phân đoạn ngẫu nhiên bằng Dnase I. Các đoạn sau đó được dùng như các primer PCR để tạo ra các trình tự gen mới được tạo thành bởi sự lai ngẫu nhiên của các đoạn. Các biến thể mới sau đó có thể được nhận dạng bằng các phương thức chọn lọc hoặc sàng lọc như đã ghi chú trước đây. Một sô ví dụ đã tạo ra bằng phương thức này như: các enzyme, cytokine và các vị trí liên kết kháng thể.
3.4. Các tương tác protein-phối tử
3.4.1. Biến đổi enzyme.
Nhiều ví dụ công nghệ protein bao gồm những thay đổi đối với enzyme để kiểm tra và biến đổi các tương tác enzyme-cơ chất. Các thí nghiệm này có thể được truy nguyên đối với những cố gắng sớm nhất ở công nghệ protein, bằng cách dùng tyrosyl-tRNA synthethase.
Các loại thay đổi bao gồm: tăng hoạt tính xúc tác; biến đổi đặc trưng cơ chất, bao gồm sự phát sinh de novo của các chức năng xúc tác mới; biến đổi các profile của pH sao cho một enzyme có thể hoạt động trong các điều kiện không sinh lý (non-physiology); cải thiện sự chống oxy hóa bằng cách thay thế các amino acid nhạy cảm với sư oxy hóa như Cys, tryptophan (Trp) hoặc methionine (Met) bằng các amino acid không thể oxy hóa như có cấu trúc không gian tương tự (sterically similar) như Ser, phenylalanine (Phe) hoặc glutamate (Glu), tương ứng; cải thiện khả năng ổn định đối với các kim loại nặng bằng cách thay thế các gốc Cys và Met và các nhóm carboxyl bề mặt; loại bỏ các kiểu phân cắt của protease; loại bỏ các vị trí mà ở đó sản phẩm xúc tác có thể liên kết cách khác để cảm ứng sự ức chế ngược allosteric.
3.4.2. Hormone agonist
Tăng ái lực liên kết của các hormone với các receptor của chúng có thể dẫn tới sự phát triển của các super-agonist với hoạt tính sinh học được tăng lên rõ rệt. Gần đây, Grossmann và cs (1998) đã mô tả sự thiết kế hợp lý các biến thể của TSH người (human thyroid-stimulating hormone) tăng hoạt tính lên 1.300 lần. Các biến thể được thiết kế dựa trên sự tương đồng với HCG (kích dục tố màng đệm của người-Human chorionic gonadotrophin), một hormone loại glycoprotein khác chia sẻ một tiểu đơn vị α chung. Thay thế các nhóm tích điện dương trong một vùng móc (loop region) của TSH đã phối hợp tăng hoạt tính .
3.4.3. Thay thế các đặc trưng liên kết
Một số ví dụ thích hợp ở đó tính đặc hiệu cho một phối tử được chuyển từ một background của một protein này đến một protein khác. Một số trường hợp đòi hỏi những thay đổi nhỏ, một số khác đòi hỏi việc chuyển ở quy mô lớn của nhiều gốc. Ví dụ, tính đặc trưng của hormone prolactin được cải biến bằng cách thay thế 8 amino acid ở receptor liên kết bề mặt để cải biến hormone bây giờ liên kết với receptor cho hormone sinh trưởng.
Các vùng protein thường có các loop region nối giữa giữa các motif cấu trúc thứ cấp khác (α-helix, β-strand). Trong một số trường hợp chức năng của các gốc protein trong các loop này và chúng có thể là đích cho các thí nghiệm thay thế tương đối đơn giản. Ví dụ, tính đặc trưng của nhân tố sinh trưởng có tính base của fibroblast được biến đổi thành có tính acid bằng cách thay thế một loop region đặc biệt.
4. Kết luận và các hướng trong tương lai
Công nghệ protein hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh. Thông qua các hướng thực tế được cho phép bởi các phương pháp phát triển phân tử, các protein mới được sản xuất cho nghiên cứu và các ứng dụng thương mại với tốc độ tăng lên hàng ngày. Trong một tương lai gần sẽ có một hiệu quả tăng lên để khai thác công nghệ trên các lĩnh vực ít ứng dụng hơn hôm nay, ví dụ trong việc hiểu được cấu trúc và chức năng của các protein màng đang tập trung phương thức dược phẩm và có thể thể hiện một phần của biosensor trong tương lai, phân phối thuốc (drug delivery) và các thiết bị ngoại vi của máy tính (computing devices).
Thiết kế protein vẫn đang còn ở giai đoạn khởi đầu. Tuy nhiên, nhiều thành tựu liên quan đến công nghệ protein cũng đã thu được cách đây khá lâu khoảng 10 năm. Nhìn chung, có thể hy vọng công nghệ protein sẽ phát triển mạnh trong thập kỷ tới.
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
 
Nguyễn Hoàng Lộc

X