Bệnh nhân ung thư vòm giai đoạn muộn sau điều trị tia xạ cobal-60 thường có tỷ lệ rất cao trong tái phát (20-35%) và trong di căn xa (từ 23-44%). Nhưng nếu sau điều trị tia xạ mà được dùng thêm thì tỷ lệ tái phát và di căn xa nói trên sẽ được giảm hẳn xuống chỉ còn khoảng 6,6%(1)
Đây là một chế phẩm gồm nhiều dược liệu chứa một số thành phần có tác dụng kích thích và tăng cường miễn dịch. Như công trình nghiên cứu I đã điều tra và công thức các thành phần đã chỉ ra. Vậy để tìm hiểu cơ chế tác dụng chúng tôi nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tế bào với số lượng TCD4 và TCD8 và nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch dịch thể với hàm lượng gama globulin và protein toàn phần của huyết thanh ở những bệnh nhân ung thư được dùng bổ sung thuốc.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
A. Nguyên liệu gồm:
1. Cần 4 loại bệnh nhân để nghiên cứu so sánh trong nghiên cứu hiện nay, đó là:
- Loại mới chẩn đoán xác định K vòm, chưa điều trị gì.
- Loại đã được điều trị tia xạ xong.
- Loại sau tia xạ được bổ sung thêm thuốc placebo.
- Loại sau tia xạ được bổ sung thêm thuốc CADEF.
2. Lấy máu và huyết thanh từ tĩnh mạch của 4 loại bệnh nhân nói trên. Máu thì chống đông bằng heparin. Huyết thanh thì để lắng và tách.
3. Các hoá chất anti CD4 và anti CD8, chất huỳnh quang đánh dấu (FITC).
4. Huyết thanh FITC conjugated anti mouse rabbit.
5. Các máy móc quan trọng gồm kính hiển vi huỳnh quang, máy điện di protein huyết thanh Titan Plus của Pháp và densitometer.
B. Phương pháp nghiên cứu: Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi áp dụng hai phương pháp chính sau:
1. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp dùng kháng thể đơn dòng clone để định loại lymphocyte theo kỹ thuật của Katalin Palocz et al 1990.
2. Phương pháp điện di protein huyết thanh trên acetate cellulose và tính kết quả của các phân đoạn protein Densitometer
Riêng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp dùng kháng thể đơn dòng để định loại lymphocyte mới và chưa phổ biến rộng nên giới thiệu kỹ hơn một chút về nguyên lý và cách tiến hành phản ứng.
Như chúng ta biết lymphocyte thuộc các quần thể và tiểu quần thế khác nhau ở từng thời kỳ phát triển và biệt hoá khác nhau. Ở màng trên bề mặt có một số kháng nguyên đặc trưng gọi là kháng nguyên biệt hoá hay nhóm biệt hoá (CD = cluster of differentiation). Hiện nay kỹ thuật huỳnh quang dùng kháng thể đơn dòng (là kháng thể được tiết ra do các tế bào sinh ra từ một tế bào mẹ và kháng thể đơn dòng đó gồm các phân tử immunoglobulin có cấu trúc và tính đặc hiệu hoàn toàn đồng nhất) nhằm để phát hiện các kháng nguyên CD. Đó là kỹ thuật hiện đại và đặc hiệu nhất để định loại các tế bào lympho.
Về nguyên lý các kháng thể tương ứng có khả năng gắn vào các kháng nguyên hoặc thụ thể nằm trên bề mặt tế bào. Để hiện tượng kết hợp này có thể nhìn thấy được bằng kính hiển vi quang học, kháng thể được đánh dấu bằng một chất phát màu huỳnh quang (fluorochrome). Có nhiều chất có khả năng phát màu chiếu sáng, trong quá trình này chất huỳnh quang là fluorescein-isothiocyanat/FITC/. FITC có thể được gắn trực tiếp vào chất kháng thể đặc hiệu, ta có kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immuno fluorescent assay). Còn trong kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (indirect immunofluorevint assy), kháng thể đặc hiệu kháng phân tử CD không đánh dấu (gọi là kháng thể thứ nhất hoặc kháng thể trực tiếp) được ủ với tế bào. Sau khi đã rửa sạch, cho ủ tiếp với kháng thể kháng kháng thể thứ nhất có đánh dấu FITC (kháng thể thứ hai hoặc kháng thể gián tiếp). Sau khi rửa đợt 2, tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật miễndịch huỳnh quang gián tiếp có độ nhạy cao hơn nhiều lần so với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp.
Phức hợp kháng nguyên – kháng thể hình thành trên bề mặt có thể di chuyển cho hình thành “mũ” (“cap” formation) hoặc rụng khỏi màng tế bào (Shedding). Để ngăn cản tình trạng này dùng natrium azide (NaN3), là một chất ức chế di chuyển ở nồng độ 0,02%. Do vậy PBS có chứa 0,02% NaN3 được dùng trong suốt quá trình kỹ thuật .
Các tế bào có ty thể Fc trên bề mặt (lymphocyte, monocyte, myelomonocyte) có khả năng gắn các phân tử immunoglobulin bị vón tụm lại (aggregated immunoglobulin) hoặc các phức hợp miễn dịch (immunecomplexes) gây ra dương tính giả, nhất là trường hợp trong chế phẩm các tế bào có nhiều monocyte hoặc các tế bào non trong bệnh bạch huyết (leukemia). Hiện tượng này có thể ngăn cản được bằng siêu li tâm kháng thể để loại bỏ immunoglobulin. Tuy nhiên phương pháp đơn giản và thuận lợi hơn là dùng immunoglobulin thô vì nó có ái lực lớn với các thụ thể Fc của người. Do vậy huyết thanh thỏ ở nồng độ 1% trong PBS được dùng để hoà loãng kháng thể nhằm mục đích phong bế thụ thể Fc trong quá trình ủ với hỗn dịch tế bào.