1. Lên men rượu
Rượu đã được con người sản xuất và sử dụng rất lâu, vào khoảng 6.000 năm trước công nguyên. Do nhu cầu và lợi ích của sản phẩm này nên đến nay việc nghiên cứu và mở rộng sản xuất chúng ngày càng được quan tâm. Có rất nhiều loại rượu và mỗi loại đều có thành phần và quy trình sản xuất khác nhau, có thể tạm chi thành ba loại chủ yếu sau: Rượu trắng (ethanol), rượu vang (wine) và rượu mùi (liquor).
1.1. Rượu trắng (ethanol)
Rượu trắng được sản xuất bằng hai phương pháp chính: phương pháp lên men vi sinh vật và phương pháp hóa học. Tuy nhiên, phương pháp lên men vi sinh vật là phương pháp chủ yếu. Đây là quá trình lên men rượu của nấm men và một số vi sinh vật khác, trong đó nấm men là đối tượng chính được sử dụng để sản xuất rượu ở quy mô công nghiệp. Lên men rượu là một quá trình phức tạp chuyển đường thành rượu, có sự tham gia của nấm men trong điều kiện yếm khí. Phương trình tổng quát của lên men rượu như sau:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + 27 kcal
Quy trình sản xuất rượu trắng bằng phương pháp lên men rượu bởi nấm men được thực hiện qua các bước sau: Chế biến nguyên liệu thành dịch đường, lên men biến đường thành rượu, chưng cất và tinh chế ethanol ethanol. Trong đó lên men biến đường thành rượu là giai đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu, quyết định chất lượng sản phẩm tạo thành. Sau khi dịch đường hóa đã được xử lý, người ta bổ sung thêm một số thành phần để cung cấp thêm vitamin và amino acid như muối ammonium, muối phosphate, dịch thuỷ phân nấm men. Môi trường có thành phần như trên có thể sử dụng để lên men. Giống được sử dụng chủ yếu trong lên men rượu là các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae có tốc độ phát triển mạnh và hoạt lực lên men cao, lên men được nhiều loại đường khác nhau và có tốc độ lên men nhanh, có khả năng chịu được độ ethanol cao từ 10-12%. Môi trường lên men sau khi được khử trùng cần có độ đường đạt 90-120 g/L và pH trong khoảng 4,5-4,8. Thời gian lên men từ 65-72 giờ, trong đó 10 giờ đầu có sục khí để nấm men sinh sôi nảy nở, sau đó cho lên men tĩnh (yếm khí). Quá trình lên men rượu qua các bước sau: đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thụ vào trong tế bào nấm men qua màng tế bào và tham gia vào quá trình trao đổi chất, rượu ethanol và CO2 tạo thành liền thoát ra khỏi tế bào, rượu ethanol tan tốt trong nước do vậy nó khuếch tán rất nhanh vào môi trường chung quanh. Kết thúc lên men rượu, sau khi đã loại bỏ tế bào nấm men, muốn được rượu tinh khiết cần chưng cất dịch lên men để loại bỏ tạp chất. Kỹ thuật chưng cất rượu ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượu thu được.
1.2. Rượu vang
Danh từ rượu vang được dùng để chỉ loại rượu lên men từ dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm, táo lê...) với một số chủng nấm men. Rượu vang thu được không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ (10-15%) là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng.
Quy trình sản xuất rượu vang đơn giản hơn lên men ethanol ethanol (rượu trắng) và qua các bước sau: Chế biến nguyên liệu và lên men tạo rượu vang.
Khi chế biến nguyên liệu thành dịch quả cần bổ sung SO2 để ngăn cản các phản ứng oxy hóa và tiêu diệt các vi khuẩn tạp nhiễm, bổ sung thêm đường để tăng quá trình chuyển hoá thành rượu của vi sinh vật, điều chỉnh độ chua vì độ chua có thể ảnh hưởng đến chất lượng nước quả cũng như làm thay đổi pH của dịch nước quả sẽ ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi sinh vật và các enzyme. Quá trình lên men tạo rượu vang được tiến hành hoặc bằng cách dùng nấm men dính trên vỏ quả (rơi vào dịch quả một cách tự nhiên) hoặc cho lên men dịch quả nhờ các chủng nấm men như Saccharomyces ellipsoideus, Sac. cerevisiae, Sac. oviformis… Lên men rượu vang bao gồm ba giai đoạn: (1) Giai đoạn hình thành rượu, bắt đầu từ lúc cấy men giống vào cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất. (2) Giai đoạn phát triển, gạn dịch lên men thu “rượu non” tiếp tục cho rượu non lên men phụ để phân hủy lượng đường còn trong dịch lên men. Quá trình gạn lọc và lên men phụ có thể lập lại nhiều lần để có dung dịch trong suốt. Ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic chuyển hóa malic acid thành lactic acid, làm cho rượu được chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu. (3) Giai đoạn vang chín, rượu non đã ổn định thành phần nhưng rượu vẫn còn “sống”, do đó cần hạ thổ rượu ở nơi mát một thời gian lâu để rượu được “chín” và có chất lượng hoàn hảo.
2. Sản xuất enzyme
Ứng dụng thương mại chính của các enzyme vi sinh vật là trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia mặc dù enzyme đã được thừa nhận trong các ứng dụng phân tích và chẩn đoán bệnh, cũng như trong sản xuất bột giặt. Hầu hết các loại enzyme được tổng hợp trong pha log của nuôi cấy mẻ và có thể, vì thế, được xem như các chất trao đổi sơ cấp. Tuy nhiên, trong một số trường hợp amylase (Bacillus stearothermophillus) được sản xuất bởi nuôi cấy idiophase vì thế có thể xem là tương đương với các chất trao đổi thứ cấp. Các enzyme có thể được sản xuất từ động-thực vật cũng như các nguồn vi sinh vật, nhưng sản xuất bằng lên men vi sinh vật là phương pháp kinh tế và thích hợp nhất. Hơn nữa, hiện nay nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta có thể chuyển gen vào các tế bào vi sinh vật để sản xuất các enzyme của động-thực vật.
Các tiến bộ của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng phạm vi các sản phẩm lên men tiềm tàng của vi sinh vật. Có khả năng đưa các gen từ các cơ thể bậc cao vào các tế bào vi sinh vật như là các tế bào nhận để tổng hợp các protein (bao gồm enzyme) ngoại lai. Các tế bào vật chủ dùng trong những trường hợp này là E. coli, Sac. cerevisiae và một số loại nấm men khác.
2.1. Các loại enzyme vi sinh vật
Trong quá trình sinh trưởng, các enzyme được hình thành trong tế bào và một số được tiết ra môi trường xung quanh. Trong sản xuất chủ yếu là sản phẩm của enzyme ngoại bào, còn nếu muốn tách enzyme nội bào thì phải phá vỡ tế bào. Các vi sinh vật được dùng trong sản xuất enzyme gồm có vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và xạ khuẩn.
Các chế phẩm enzyme được sản xuất từ vi sinh vật đã được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, chủ yếu là các enzyme thủy phân: amylase, protease, pectinase, cellulase…
2.1.1. Amylase nấm mốc
Nhiều chủng nấm mốc có khả năng sản xuất enzyme amylase. Amylase nấm mốc có các loại sau:
- α-amylase có tác dụng thủy phân tinh bột thành maltose, glucose và các dextrin có phân tử lượng khác.
- Glucoamylase có tác dụng thủy phân tinh bột, glycogen và polysaccharide. Enzyme này được dùng trong sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợp chất lên men được và do đó nâng cao được hiệu suất nấu rượu từ các nguyên liệu là tinh bột.
- α-glucosidase thủy phân maltose thành glucose.
- Dextrinase thủy phân isomaltose, panose và dextrin thành những loại đường có thể lên men được.
2.1.2. Amylase vi khuẩn
Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme α-amylase. Amylase vi khuẩn chỉ có khả năng phân hủy tinh bột mạnh và tạo thành những α-dextrin phân tử lượng cao bắt màu với iod. Enzyme α-amylase vi khuẩn được dùng trong sản xuất đường mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, chế biến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ em, trong sản xuất nước quả và trong y học.
Dextrinase nấm mốc và amylase vi khuẩn còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt và giấy.
2.1.3. Protease
Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein hoặc các polypeptide.
- Protease thủy phân protein thành các peptide có phân tử lượng nhỏ (peptone và polypeptide). Tiếp theo đó là sự phân hủy các peptide trên thành các amino acid tự do dưới tác dụng của peptidase.
- Protease được dùng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thịt cá, thủy phân protein của sữa để chế biến những món ăn kiêng đặc biệt, được dùng trong thuộc da, sản xuất bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ và trong y học. Protease vi sinh vật có thể sử dụng cùng với amylase trong chế biến thức ăn gia súc.
2.1.4. Pectinase
Là nhóm enzyme thủy phân pectin tạo thành galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, methanol… Pectinase có nhiều loại, nhưng có hai loại được nghiên cứu nhiều hơn cả là pectinesterase và polygalacturonase.
- Pectinesterase có tác dụng thủy phân các liên kết ester trong phân tử pectin, tách nhóm metocyl tạo thành methanol và polygalacturonic acid.
- Polygalacturonase thủy phân pectinic acid và các polygalacturonic khác, tách các gốc D-galacturonic acid tự do.
2.1.5. Cytolase
Vi sinh vật (đặc biệt là nấm mốc) sản sinh ra hệ enzyme có hoạt tính cao có thể phân hủy hemicellulose, pentozan, lignin… Các enzyme này được gọi chung là cytolase (bao gồm cellulase, hemicelllulase, pentosinase).
Cellulase tác dụng phân hủy cellulose thành cellobiose, rồi sau đó tiếp tục thủy phân tới glucose. Việc phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất cellulase có hoạt tính cao và tách enzyme này ra dưới dạng tinh khiết vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, hiện nay chưa sản xuất được enzyme này ở quy mô công nghiệp, song việc sử dụng nó trong các ngành kinh tế và công nghiệp có nhiều tiềm năng. Ví dụ: cytolase có thể dùng trong công nghiệp bia để phân hủy các vỏ hạt không phải vỏ mạch, trong sản xuất nước quả, trong chế biến bánh mì, trong các quá trình gia công thực phẩm để nâng cao giá trị dinh dưỡng, cũng như trong sản xuất thức ăn gia súc.
2.1.6. Invertase
Invertase của nấm mốc và nấm men đều thủy phân saccharose, nhưng cơ chế tác dụng của chúng hoàn toàn khác nhau. Invertase của nấm mốc là glucosidase, tác dụng lên đầu glucose của saccharose. Còn invertase của nấm men là fructosidase, tác dụng lên đầu fructose của saccharose.
Invertase là enzyme nội bào và chỉ thoát ra môi trường khi tế bào bị phân hủy. Enzyme này được dùng rộng rãi trong sản xuất bánh kẹo, rượu mùi, kem, mật ong nhân tạo. Nó làm tăng vị ngọt khi thủy phân đường saccharose thành fructose và glucose, làm tăng độ hòa tan của saccharose trong sản phẩm.
2.1.7. Enzyme oxy hóa glucosooxydase-catalase
Glucosooxydase là enzyme oxy hóa khử, chỉ tác dụng lên β-D-glucose khi có mặt oxy, nó oxy hóa glucose thành gluconic acid và H2O2. Dưới tác dụng của catalase (một enzyme hay đi cùng với glucosooxydase) H2O2 sẽ bị khử thành H2O và O2.
Glucosooxydase-catalase có thể loại bỏ oxygen không khí khỏi môi trường. Vì vậy, chúng được dùng để bảo vệ những nguyên liệu, vật liệu khác nhau để tránh oxy hóa bởi không khí. Sử dụng những enzyme này cho phép kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm (các dịch cô đặc, chất béo, bia, rượu vang, nước uống, sữa…). Đồng thời chúng cũng được sử dụng rộng rãi trong y học từ năm 1950 để chữa bệnh.
2.2. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng
Những enzyme được tạo thành trong tế bào vi sinh vật không phải chỉ phụ thuộc vào hoạt tính riêng của từng loại vi sinh vật, mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy nấm mốc Asper. oryzae trên môi trường cám mì theo phương pháp bề mặt có hàng chục enzyme tự do được hình thành, trong đó có amylase, protease, mantase, pectinase, invectase, ribonuclease... Nếu nuôi nấm mốc này trên môi trường Kzapek với tinh bột và nitrate thì chỉ có α-amylase được tạo thành, còn các enzyme khác chỉ có ở dạng vết. Nhưng nếu thay sodium nitrate bằng casein ở dạng sữa đã tách chất béo thì protease được tạo thành cùng với α-amylase.
Tương tự như vậy khi nuôi cấy bề mặt nấm mốc Asper. awamori trên cám sẽ thu được một số lớn glucoamylase, α-amylase, protease, pectinase, cellulase; nhưng khi nuôi chìm trên môi trường chứa tinh bột và nitrate thì chỉ thu được phức hợp amylase.
Hiện tượng này có thể giải thích bằng lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng enzyme, nó chỉ xảy ra trong khi nuôi cấy vi sinh vật mà không thấy ở động-thực vật. Những enzyme thủy phân của vi sinh vật đều thuộc hệ enzyme cảm ứng. Khi trong môi trường nuôi cấy có một chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường một hoặc những enzyme tương ứng để phân hủy nó thành những chất có thể đồng hoá được.
Một định nghĩa tổng quát có thể nêu lên như sau: Một quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng, nếu như nó chỉ xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất. Các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng. Các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp này được gọi là chất cảm ứng.
Muốn tổng hợp được enzyme cảm ứng cần phải có bốn điều kiện:
- Có gen tương ứng trong thể nhiễm sắc của tế bào.
- Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phân tử enzyme đó (các amino acid và các hợp chất coenzyme nếu enzyme đó gồm hai cấu tử).
- Năng lượng cần thiết dùng cho việc tổng hợp enzyme.
- Chất cảm ứng, nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ ba điều kiện trên cũng không thể tổng hợp được enzyme. Như vậy, có thể coi việc có chất cảm ứng là điều kiện rất cần thiết để thu được những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất.
2.3. Những phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới ứng dụng hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
Trong nuôi cấy bề mặt, vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng. Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Vi sinh vật phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxygen phân tử của không khí để hô hấp. Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc đều trên bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng sinh ra enzyme, những lớp môi trường rắn cần phải mỏng (chỉ dày khoảng 2-5 cm). Điều này dẫn đến một nhược điểm cơ bản của phương pháp này cần phải có mặt bằng sản xuất lớn và chi phí lao động chân tay nhiều.
Trong nuôi cấy chìm, vi sinh vật hiếu khí chỉ sử dụng được oxy hòa tan trong môi trường, vì vậy trong quá trình nuôi cấy phải sục khí và khuấy liên tục. Phương pháp nuôi cấy chìm hiện đại hơn, dễ cơ khí hóa và tự động hóa, việc tổ chức quy mô lớn tương đối dễ dàng và đơn giản. Với phương pháp này có thể dùng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn các thành phần môi trường thích hợp, các điều kiện nuôi cấy tối ưu.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn cũng có một số ưu điểm so với phương pháp nuôi cấy chìm, đó là: nồng độ enzyme tạo thành ở môi trường rắn cao hơn nhiều lần, không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, quá trình sản xuất tiêu tốn ít năng lượng. Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật được nuôi cấy trong điều kịên không vô trùng tuyệt đối. Nếu có vi sinh vật tạp nhiễm thì chỉ cần loại bỏ phần đó. Còn trong nuôi cấy chìm cần phải giữ vô trùng tuyệt đối trong tất cả quá trình, nếu bị nhiễm thì hư hỏng toàn bộ và có thể phải bỏ đi hoàn toàn. Khi nuôi cấy chìm không những chỉ cần vô trùng ở quá trình nhân giống, lên men, mà còn phải đảm bảo vô trùng đối với không khí thổi vào môi trường.
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn, một số trường hợp có thể dùng môi trường lỏng.
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô… hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này. Môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có pha thêm muối khoáng.
Để đảm bảo đủ các chất dinh dưỡng trong môi trường người ta có thể bổ sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trưởng (nước khoai tây, cao ngô…). Độ ẩm 58-60% tương đối thích hợp với nhiều chủng nấm mốc nuôi cấy bề mặt trên khay hở. Tuy nhiên, độ ẩm 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí. Trường hợp độ ẩm từ 45-50%, khi nuôi cấy môi trường sẽ khô nhanh, bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành. Trong thời gian nuôi cấy, nên giữ độ ẩm của môi trường ở 50-60%, muốn vậy độ ẩm không khí phòng nuôi cấy phải khoảng 90-100%.
Tuy rằng, nuôi cấy bề mặt không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối nhưng môi trường (đặc biệt trong quá trình nhân giống) cũng cần được vô trùng để cho giống phát triển bình thường nhất là giai đoạn đầu. Trong sản xuất cần phải vô trùng môi trường rắn ở 1-1,5 atm bằng hơi nóng trong 45-60 phút. Nếu môi trường trước khi vô trùng được trộn với chlohydric acid hoặc sulfuric acid đến pH thích hợp, hay thêm một ít formalin hoặc một số chất sát trùng khác thì chỉ cần vô trùng dưới ở 0,2-0,3 atm. Thêm acid và giữ môi trường ở pH nhất định sẽ giúp cho một vài enzyme tạo thành được nhiều hơn. Môi trường được dàn mỏng ra các khay đã vô trùng dày khoảng 2-2,5 cm, để nguội tới 30oC thì tiến hành cấy giống. Giống được nhân cũng theo phương pháp bề mặt hoặc bằng bào tử thu được theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường nhân giống và chứa vào các bình nút kín hoặc trong các túi polyethylene. Trong nuôi cấy nhân giống thường để mốc phát triển đến già sinh ra nhiều bào tử. Tỷ lệ nhân giống khoảng 0,2-2%. Mỗi gram bào tử mốc có thể cấy vào 10 kg môi trường. Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thông gió. Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32oC, nếu nhiệt độ xuống dưới 24oC nấm phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme. Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36-60 giờ.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi trường bao gồm ba thời kỳ:
- Khoảng 10-14 giờ đầu. Bào tử bắt đầu nảy mầm, thời kỳ này chưa hình thành enzyme không đòi hỏi phải thông khí nhiều, chỉ cần làm thoáng khoảng 2-3 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ. Giống rất nhạy cảm với nhiệt độ ở những giờ này, nhiệt độ buồng nuôi cần giữ 29-31oC .
- Thời kỳ giữa khoảng 14-18 giờ. Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh. Sợi nấm có thể quan sát thấy bằng mắt thường, lúc đầu lớp lông có màu trắng xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại. Có thể phải lật môi trường, bẻ nhỏ ra để sợi nấm mọc tốt hơn. Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80-90 kcal/giờ, làm nhiệt độ môi trường có thể tăng lên đến 37-40oC hoặc hơn. Thời kỳ này cần phải thông khí mạnh, tới 60 thể tích khí/1 thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc và đuổi CO2 ra khỏi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28-29oC và độ ẩm trong phòng khoảng 100%.
- Thời kỳ cuối khoảng 10-20 giờ. Các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, nhiệt độ môi trường giảm xuống và việc tạo thành enzyme của tế bào vẫn tiếp tục. Nhiệt lượng tỏa ra khoảng 15-30 kcal/kg/giờ. Thông khí không quá 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi ở 30oC.
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng gốc mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme theo phương pháp chìm ở quy mô công nghiệp được thực hiện trong các thùng lên men có khuấy và thổi khí liên tục. Quá trình tương tự như trong sản xuất amino acid, kháng sinh…
Không thể có môi trường nuôi cấy chung cho tất cả các chủng vi sinh vật, vì vậy cần phải chọn thành phần môi trường, tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích hợp với từng chủng, đặc biệt phải chú ý tới chất cảm ứng cần thiết để cho vi sinh vật sản sinh ra enzyme ở mức tối đa. Trong nhiều môi trường nuôi cấy chìm, nguồn carbon thường là tinh bột hoặc các loại bột khác nhau. Có thể thêm một lượng rất hạn chế các carbohydrate dễ tiêu như glucose hoặc saccharose. Trong sản xuất người ta còn sơ bộ dịch hoá tinh bột bằng amylase trước khi hấp vô trùng môi trường. Đối với các mốc sinh amylase thì đường maltose lại là chất cảm ứng tốt hơn tinh bột. Các nguồn N hữu cơ thường dùng là cao ngô, nước chiết từ mầm mạ… Nhưng khi cho thêm các chất này phải thận trọng, vì hỗn hợp các amino acid sẽ có tác dụng nâng cao sinh tổng hợp amylase ở Aspergillus nhưng lại có ảnh hưởng xấu đối với các enzyme khác.
Thành phần khoáng trong môi trường cũng rất có ý nghĩa. Trong môi trường nuôi cấy một số chủng Asper. oryzae ngoài tinh bột và nitrate cần thêm MnSO4. Nếu thiếu MnSO4 mốc vẫn phát triển bình thường, nhưng amylase không được tạo thành (trong phân tử amylase có chứa những amino acid mang S và Mn). Môi trường được vô trùng trong thiết bị riêng hoặc trong thùng lên men ở 128-125oC/45-60 phút. Môi trường trước khi vô trùng cần được dịch hóa sơ bộ để tránh tình trạng tinh bột hồ hóa làm môi trường đặc sệt hoặc có độ dính cao.
Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ thích hợp sẽ tiến hành tiếp giống. Giống được cấy từ ống nghiệm qua các bình tam giác, đặt trên máy lắc, rồi nuôi ở bình nhân giống có thể tích bằng 5-10% thể tích bình lên men từ 24-36 giờ. Như vậy, nuôi cấy chìm cần tiếp giống ở hệ sợi không dùng giống bào tử như cấy các xạ khuẩn sinh chất kháng sinh. Cấy giống mốc bào tử theo phương pháp chìm sẽ kéo dài thời gian nảy mầm và cũng kéo dài toàn bộ quá trình nuôi cấy. Môi trường nhân giống có thể dùng các hợp chất N dễ tiêu đối với vi sinh vật mà trong quá trình nuôi cấy vẫn nâng cao được hoạt tính sinh tổng hợp. Tỷ lệ tiếp giống nằm trong khoảng 2-5%, nhưng ở một số chủng tỷ lệ này thấp hơn nhiều (0,5-0,6%).
Sinh tổng hợp enzyme theo phương pháp nuôi cấy chìm thường khoảng từ 2-4 ngày. Đa số các enzyme thuỷ phân do nấm mốc, xạ khuẩn tạo thành được tiết ra môi trường xung quanh, phần còn lại trong hệ sợi sau ba ngày nuôi cấy khoảng 10-15%. Độ pH môi trường có một ý nghĩa rất lớn, độ pH thích hợp cho sinh tổng hợp α-amylase là 7-8, glucoamylase là 4,5-5. Khi dùng các muối ammonium làm nguồn N, quá trình phát triển vi sinh vật sẽ acid hóa môi trường còn khi dùng nitrate làm nguồn N môi trường sẽ bị kiềm hóa.
Sự sục khí không những ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme. Tốc độ sử dụng oxygen cao nhất của nấm mốc sau khoảng 24 giờ nuôi cấy rồi giảm dần. Tăng nồng độ tất cả các chất dinh dưỡng và O2 hòa tan trong môi trường có thể nâng cao được khả năng sinh tổng hợp α-amylase.
2.4. Tách và tinh sạch chế phẩm enzyme
2.4.1. Chế phẩm enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (ethanol, acetone). Nhiều nghiên cứu cho thấy dùng nước có kết quả tốt và dễ áp dụng trong sản xuất. Có thể chiết được lượng enzyme trên 90-95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25-28oC. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít formalin hoặc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10-15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10-12oC.
Dịch chiết được cô đặc chân không tới 50-55% chất khô hòa tan. Dịch đậm đặc này có thể bảo quản lâu dài mà không mất hoạt tính và rất dễ hòa tan. Dịch chiết có thể không cần phải cô đặc mà đưa ngay vào máy sấy phun và sẽ thu được sản phẩm ở dạng bột.
Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và acetone). Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỷ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì vậy, các enzyme-protein cũng như các chất có phân tử lượng thấp trong hệ dung dịch nước-dung môi hữu cơ sẽ kết tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch ethanol-nước phụ thuộc vào nồng độ ethanol, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Thông thường, người ta thêm 3-4 thể tích ethanol vào một thể tích nước chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme tất cả phải được làm lạnh xuống 3-5oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng xuống duới cần tách ly tâm ngay. Enzyme được rửa 2-3 lần bằng ethanol cao độ, rồi đưa vào bình hút ẩm hoặc máy đông khô chân không, sản phẩm thu được sẽ có dạng bột. Dùng isopropanol kết tủa enzyme chỉ cần 1,5-2 thể tích dung môi/1 thể tích dịch chiết. Các enzyme tách ra sẽ ở dạng sữa đặc quánh rất khó sấy. Dùng acetone với tỷ lệ như khi dùng isopropanol, nhưng kỹ thuật tránh cháy nổ trong sản xuất là rất khó khăn.
Phương pháp thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết tủa. Chế phẩm enzyme thu được có hoạt lực cao hơn so với việc tách bằng dung môi. Muối trung tính thường dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50-66% (có khi cao hơn) so với dịch chiết enzyme. (NH4)2SO4 pha thành dung dịch bão hòa rồi cho vào dịch lên men. Dịch lên men có thể sơ bộ cô đặc trong thiết bị chân không và như vậy sẽ cần dùng một lượng (NH4)2SO4 ít hơn. Chế phẩm enzyme thu được có lẫn (NH4)2SO4, vì vậy muốn sử dụng rộng rãi cần phải loại muối bằng cách thẩm tích qua màng bán thấm.
2.4.2. Chế phẩm enzyme từ dịch nuôi cấy chìm
Dịch nuôi cấy chìm sau khi lọc sinh khối vi sinh vật và các tạp chất rắn không tan còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có các enzyme. Về nguyên tắc tách enzyme từ dịch lọc nuôi chìm cũng tương tự như tách từ dịch chiết trong môi trường rắn nuôi cấy bề mặt. Dịch lọc cần phải cô để giảm thể tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân không ở 25-30oC, rồi tiến hành tách enzyme.
Ngoài phương pháp cô chân không, có thể tiến hành theo phương pháp hấp thụ qua nhựa trao đổi ion hoặc các chất có hoạt tính bề mặt, sau đó lại tiến hành phản hấp phụ. Tiến hành nhiều lần và dịch thu được chứa α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn có thể được hấp phụ lại bằng tinh bột khoai tây hoặc ngô đã được xử lý sơ bộ bằng nhiệt. Trước khi cho hấp phụ cần cho thêm 20% (NH4)2SO4 để nâng cao khả năng hấp phụ của tinh bột. Trừ amylase được hấp phụ còn các enzyme khác sẽ ở lại trong dịch. Tinh bột có amylase được sấy khô (không cần phản hấp phụ) và đem sử dụng trong kỹ thuật sản xuất các sản phẩm chứa tinh bột.
Hiện nay còn một số phương pháp tương đối phức tạp khác để kết tinh và tách enzyme như: lọc gel (gel filtration), điện di (electrophoresis), siêu ly tâm (ultracentrifuge)…
3. Sản xuất kháng sinh
3.1. Penicillin
Penicillin là kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùng để chữa một số bệnh nhiễm khuẩn vào những năm đầu của Thế chiến thứ 2.
Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc Penicillum và Asperergillus. Nhưng các chủng của Penicillum notatum và Pen. chrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh. Tuy nhiên, những chủng Penicillum có hoạt lực cao lại thường kém ổn định. Do đó, một vấn đề khó khăn được đặt ra là tạo được khả năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp. Ngày nay, nhờ di truyền học người ta đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ vẫn không giảm họat tính kháng sinh.
Quá trình lên men penicillin thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng và pha sinh penicillin. Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm Pen. chrysogenum có thể là glucose, saccharose, lactose, tinh bột, dextrin, các acid hữu cơ (lactic, acetic, formic), các amino acid... Tuy nhiên, đường lactose có hiệu suất penicillin cao nhất và thường được dùng trong công nghiệp. Nhưng do nấm sử dụng đường lactose chậm, vì vậy trong thực tế lactose được dùng phối hợp cùng với đường khác (glucose, saccharose...) trong môi trường dinh dưỡng.
Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucose và lactic acid của cao ngô. Sau đó, lactose mới được sử dụng (chủ yếu trong pha thứ hai tạo thành penicillin). Khi trong môi trường cạn lactose và không bổ sung các chất dinh dưỡng hệ sợi nấm sẽ bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điểm này.
3.1.1. Các phương pháp sản xuất penicillin
Sản xuất penicillin cũng như các chế phẩm sinh học khác, dựa trên cơ sở nuôi cấy vi sinh trên môi trường rắn hoặc lỏng. Trong quá trình nuôi cấy, giống vi sinh vật phát triển sẽ tích tụ các sản phẩm trao đổi chất trong môi trường hoặc trong sinh khối. Quy trình công nghiệp sản xuất penicillin dựa trên nấm mốc Pen. chrysogenum có khả năng sinh penicillin cao, theo hai phương pháp:
- Lên men bề mặt. Phương pháp này được áp dụng trong thời gian đầu của công nghiệp kháng sinh. Môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất rắn hoặc lỏng. (1) Cơ chất rắn có thể là cám hoặc các loại hạt, cám được làm ướt rồi trải lên khay một lớp dày khoảng 2 cm, giống nấm mốc được trộn vào môi trường có độ ẩm 50-60% đã vô trùng để nguội tới 30oC. Thời gian lên men 6-7 ngày ở 24-28oC trong các buồng được điều chỉnh nhiệt độ, độ ẩm và thông gió. Nói chung, phương pháp này giống như lên men các enzyme bằng nấm mốc. (2) Môi trường lỏng dùng nguồn carbon là lactose, cao ngô và một số nguyên tố khoáng. Giống được cấy vào môi trường rồi lên men ở 24oC khoảng 6-7 ngày đạt hiệu suất khoảng 193 unit/mL penicillin. Ngày nay phương pháp lên men chìm đã thay thế phương pháp lên men bề mặt.
- Lên men chìm. Thành phần môi trường gồm có cao ngô, glucose, lactose và các muối khoáng. Giống dùng trong công nghiệp thường ở dạng bào tử. Bào tử được nuôi trên các thùng nhân giống có khuấy và sục khí 36-50 m3/giờ để hệ sợi nấm phát triển, sau đó chuyển vào các thùng lên men. Quá trình lên men penicillin bằng nấm mốc Pen. chrysogenum ở 26 ± 1oC trong khoảng 120-125 giờ. Trong quá trình lên men ở pha thứ nhất nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, các nguồn carbon dễ đồng hóa (glucose, saccharose) cùng các nguồn nitrogen được tiêu hao nhanh, cường độ hô hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng và penicillin được tạo thành ít. Sang pha thứ hai hệ sợi nấm phát triển chậm, lactose được tiêu hao dần, pH tăng đến khoảng 7-7,5 và penicillin được tạo thành chủ yếu trong pha này. Nếu nguồn carbon trong môi trường cạn và sinh khối nấm mốc bắt đầu tự phân thì pH có thể tăng tới 8 hoặc hơn, lượng penicillin được tạo thành trong môi trường sẽ giảm. Vì vậy, quá trình lên men cần được kết thúc trước thời điểm hệ sợi nấm mốc bắt đầu tự phân. Nấm mốc sinh penicillin rất hiếu khí, cho nên quá trình nuôi cấy (nhân giống và lên men) cần phải sục khí và khuấy môi trường để đảm bảo độ hòa tan O2 cân bằng với nhu cầu sinh lý của chúng. Nếu không đủ O2 hiệu suất penicillin có thể giảm tới hai lần.
3.2. Streptomycin
Streptomycin là một kháng sinh dùng phổ biến trong y học, thú y và bảo vệ thực vật. Schatz và cs (1944) đã phát hiện ra streptomycin từ dịch nuôi cấy một chủng xạ khuẩn Streptomyces griseus (còn gọi là Actinomyces streptomycin).
Giống xạ khuẩn sinh streptomycin khi nuôi cấy chìm phát triển thành hai pha:
- Pha thứ nhất (pha sinh trưởng mạnh). Các bào tử nảy chồi và mọc thành sợi sau 6-8 giờ, mỗi bào tử mọc một chồi, khuẩn ty thường thẳng và phân nhánh rất yếu, tế bào chất ưa kiềm.
- Pha thứ hai (khuẩn ty không phát triển). Cuối ngày thứ ba sợi xạ khuẩn bị chia nhỏ và bắt đầu tự phân.
Những giống sinh streptomycin rất không ổn định. Do đó, trong tương lai cần có sự can thiệp của kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống có hoạt lực cao và ổn định để đưa vào sản xuất. Giữ bào tử ở dạng đông khô trong khoảng năm năm có thể còn 96-99% hoạt lực, trong cát thạch anh tới ba năm, trên môi trường thạch nước đậu ở 5oC tới một năm. Các nguồn carbon mà giống Streptomyces có thể đồng hóa được và sinh kháng sinh là glucose, tinh bột, dextrin, maltose, fructose, galactose, manose. Trong thực tế, glucose và tinh bột được dùng làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất streptomycin.
3.2.1. Các phương pháp sản xuất streptomycin
Lên men streptomycin được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm. Quá trình lên men này cũng giống như lên men các loại kháng sinh khác, bao gồm các giai đoạn: Nhân giống và lên men chính.
- Nhân giống. Giống xạ khuẩn được bảo quản ở dạng bào tử. Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác lắc 180-220 vòng/phút ở 26-28oC/30-70 giờ, sau đó cho tiếp vào các nồi nhân giống (có sục khí và khuấy), nuôi tiếp cho phát triển sinh khối 20-40 giờ. Nhiệm vụ chính trong giai đoạn nhân giống là tạo ra một khối lượng lớn khuẩn ty xạ khuẩn ưa kiềm có khả năng phát triển mạnh trong giai đoạn lên men chính và tạo thành một lượng lớn kháng sinh.
- Lên men. Lên men streptomycin là quá trình lên men hai pha điển hình. Nhiệt độ lên men khoảng 26-28oC, thời gian lên men 96 giờ. Trong thời gian lên men cần phải thông khí và khuấy trộn môi trường. Lượng không khí thổi qua môi trường trung bình là 1 thể tích/1 thể tích môi trường. Khuấy môi trường liên tục trong suốt cả quá trình lên men (kể cả khi nhân giống) nếu ngừng khuấy chỉ trong một thời gian ngắn sẽ làm giảm hiệu suất streptomycin. pH trong những giờ đầu có giảm chút ít sau đó tăng dần.
3.3. Tetracyclin
Tetracycline là một dãy các chất kháng sinh có cùng một nhân chung tetracycline (ví dụ: tetratcycline, chlotetracycline, oxytetra-cycline, dimethyltetracycline…) và một số nhóm chung có trong phân tử (ví dụ: nhóm dimethylamino -N(CH3)2, nhóm amide CONH2…). Tetracycline được dùng rộng rãi trong y học và chăn nuôi. Tetracycline có thể được sản xuất bằng lên men xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens. Tetracycline được tìm thấy vào năm 1953 bằng cách khử halogen trong phân tử chlotetracycline. Lúc đầu phương pháp này được dùng trong công nghiệp nhưng giá thành sản phẩm rất đắt, sau đó người ta tìm thấy chất kháng sinh này có trong dịch nuôi cấy xạ khuẩn sinh chlotetracycline là Strep. aureofaciens. Giống xạ khuẩn có khả năng tổng hợp tetracycline và chlotetracycline là Strep. aureofaciens, còn giống sinh oxytetra-cycline là Strep. rimosus. Nguồn carbon dùng trong nuôi cấy Strep. aureofaciens là glucose (tích tụ nhiều tetracycline), còn Strep. rimosus cho nhiều oxytetracycline trên môi trường maltose.
Trong quá trình lên men, ở pha thứ nhất các chất dinh dưỡng tiêu hao nhanh. Trong khoảng 24-48 giờ nuôi cấy khối khuẩn ty đã được 70-80% mức tối đa và 60-80% các chất dinh dưỡng đã được sử dụng. Bước sang pha lên men thứ hai các giống xạ khuẩn này đều phát triển chậm lại, tốc độ sử dụng các chất dinh dỡng giảm đi rất nhiều, phát triển khuẩn ty chậm lại dần, đạt tới mức độ cực đại và ổn định rồi bước vào giai đoạn tự phân. Kháng sinh tích tụ tối đa ở 110-120 giờ.
3.3.1. Các phương pháp sản xuất tetracycline
Lên men tetracycline (tetracycline, chlotetracycline, oxytetra-cycline, dimethyltetracycline…) theo phương pháp nuôi cấy chìm. Quá trình lên men ở đây giống như lên men các chế phẩm khác, bao gồm các giai đoạn: nhân giống và lên men.
- Xạ khuẩn Strep. aureofaciens dùng trong lên men tetracycline và chlotetracycline hoặc các halogentetracycline khác. Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác pH 6,8-7,0 lắc 220-250 vòng/phút khoảng 24-40 giờ. Sau đó được tiếp tục nhân giống trong nồi nhỏ rồi chuyển vào môi trường lên men. Lên men tetracycline và chlotetracycline là lên men hai pha điển hình.
- Giống Strep. rimosus được nhân giống ở bình tam giác 220-250 vòng/phút khoảng ở 27-28oC/48-72 giờ, nhân tiếp tục trong nồi có sục khí và khuấy. Sau đó chuyển sang môi trường lên men có khuấy và sục khí liên tục ở 27-28oC/5-7 ngày.
4. Sản xuất acid hữu cơ
4.1. Acetic acid
Acetic acid (CH3COOH) có thể thu được bằng phương pháp lên men vi khuẩn acetic. Acid này (còn gọi là dấm ăn) được dùng trong chế biến thực phẩm, ướp chua rau quả. Quá trình lên men nhờ vi khuẩn acetic acid oxy hóa rượu ethanol thành acetic acid
Có trên 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men acetic, chúng được gọi một tên chung là vi khuẩn acetic. Trong môi trường đủ rượu ethanol (5-13%) thì sản phẩm chủ yếu là acetic acid, nếu nồng độ rượu thấp hơn các vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa triệt để rượu thành CO2 và H2O.
Vi khuẩn acetic là bọn ưa ấm và rất hiếu khí, có tốc độ sinh trưởng rất nhanh từ một tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 12 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo thành acetic acid và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng. Vì vậy, trong sản xuất dấm có thể dùng rượu không cần vô trùng được bổ sung một ít acetic để acid hóa môi trường, nhiệt độ lên men khoảng 25-32oC và sục khí mạnh.
Các loài vi khuẩn acetic có giá trị như: Acetobacter aceti, Ace. pasteurianum, Ace. orleaneuse, Ace. xylium, Ace. schiitzenbachii, Ace. curvum, Ace. suboxydans.
Nguồn cơ chất chủ yếu trong lên men acetic là ethanol có bổ sung thêm một ít đường, nguồn nitrogen vô cơ hoặc hữu cơ, và một số chất khoáng khác. Có ba phương pháp lên men acetic: (1) Phương pháp chậm còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp, dùng nước hoa quả làm nguyên liệu với vi khuẩn Ace. orleaneuse. (2) Phương pháp nhanh còn gọi là phương pháp Đức, phương pháp này được áp dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất dấm ăn trên thế giới, vi khuẩn được sử dụng là Ace. schiitzenbachii hoặc Ace. curvum. (3) Phương pháp lên men chìm, đây là kiểu lên men bán liên tục sử dụng các chủng vi khuẩn của loài Ace. suboxydans.
4.2. Citric acid
Citric acid hay limonic acid (C6H8O7) có nhiều trong thiên nhiên, đặc biệt trong các loài cây ăn quả có múi (họ Rutaceae) được dùng chủ yếu trong chế biến thực phẩm và dược phẩm. Citric acid cũng có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp lên men, nấm mốc sẽ chuyển hóa đường thành citric acid.
Cơ chế sinh tổng hợp citric acid ở vi sinh vật có thể biểu diễn bằng phương trình tổng quát như sau:
2C6H12O6 + 3O2 → 2C6H8O7 + 4H2O
Các nấm mốc sinh citric acid hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho phát triển và lên men là 30-32oC. Nguồn carbon tốt nhất đối với Asperer. niger là saccharose, còn đối với Citromyces là maltose. Nồng độ đường trong môi trường 10-20% là thích hợp hơn cả. Các nguồn nitrogen vô cơ dùng trong lên men citric acid tốt nhất là nitrate còn nitrogen hữu cơ là nước chiết đậu nành. Trong môi trường lên men cần chú ý các nguyên tố khoáng P, Mg, K, Fe và Zn.
Có hai phương pháp được dùng để sản xuất citric acid là lên men bề mặt (trên môi trường lỏng hoặc rắn) và lên men chìm.
- Phương pháp lên men bề mặt trên môi trường lỏng. Phương pháp này được dùng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất citric acid. Lớp váng nấm phát triển trên các khay lên men chứa môi trường dinh dưỡng là dịch đường sẽ chuyển hóa đường thành citric acid.
- Phương pháp lên men chìm. Quá trình lên men giống như sản xuất kháng sinh, được thực hiện trong các thùng lên men chứa môi trường dinh dưỡng và giống nấm mốc. Sau khi kết thúc lên men dùng H2SO4 để chuyển calcium citrate thành citric acid.