Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protein, đặc biệt là các enzyme, đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Phần lớn enzyme sử dụng trong công nghiệp là các protein ngoại bào từ các cơ thể như Aspergillus sp. và Bacillus sp., bao gồm: α-amylase, β-glucanase, cellulase, dextranase, protease và glucoamylase. Nhiều loại trong số này vẫn còn được sản xuất từ các chủng gốc tự nhiên của vi sinh vật. Tuy nhiên, trong sản xuất protein/enzyme để sử dụng trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng và cho các ứng dụng trị liệu, công nghệ protein/enzyme và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng. Công nghệ DNA tái tổ hợp, ngoài việc cho phép cải thiện hiệu suất lớn lao, nó cũng cho phép chuyển các vật liệu di truyền từ động vật vào vi khuẩn vật chủ. Trong phương thức này, các protein chỉ có một lượng nhỏ từ mô động vật bây giờ có thể được sản xuất trong một lượng gần như vô hạn từ các vi khuẩn sinh trưởng dễ dàng. Một ví dụ điển hình là hormone sinh trưởng của người; chất này được sản xuất mỗi lần với một lượng nhỏ từ tuyến yên, trước khi nó được thừa nhận hiện diện một rủi ro tiềm tàng đối với bệnh nhân từ sự nhiễm bẩn prion là yếu tố được ám chỉ trong hội chứng Creutzfeld-Jacob. Hormone sinh trưởng người bây giờ được sản xuất với một lượng lớn hơn rất nhiều từ vi khuẩn E. coli và nó hoàn toàn sạch không bị nhiễm prion không mong muốn.
Các enzyme hoặc protein được sản xuất bằng vi sinh vật có thể ở nội bào, ở khoang gian bào hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy. Đối với các enzyme ngoại bào, mức độ tinh sạch cần thiết thường là tối thiểu, khi sản phẩm cuối cùng được dùng trong công nghiệp và không cần độ tinh sạch cao. Các quá trình quy mô lớn như thế có thể cho sản lượng sản phẩm protein lên đến hàng tấn.
Nhiều loại loại protein/enzyme được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng. Những protein/enzyme được tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong trị liệu, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao, và để có được điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp. Một lần nữa, công nghệ DNA tái tổ hợp đã có đóng góp hiệu quả trong lĩnh vực này. Trong trường hợp các protein trị liệu, thường có những thuận lợi nếu protein quan tâm có thể được tiết hoặc vào khoảng gian bào hoặc vào trong môi trường. Điều này giúp giảm rất lớn độ nhiễm bẩn của protein và các đại phân tử khác, sản phẩm tinh sạch như thế thường thu được chỉ trong hai hoặc ba bước tinh sạch. Chọn lựa hệ thống biểu hiện thích hợp có thể cho hiệu quả cao hơn trong hệ lên men, có liên quan tới việc cải thiện hoạt tính đặc biệt của nguyên liệu khởi đầu. Cũng có khả năng bổ sung các nhóm chức vào protein để giúp cho sự tinh sạch do tạo ra cho nó các tính chất đặc biệt và sau đó loại bỏ các nhóm chức này khi chúng không được yêu cầu lâu hơn.
Trong thiết kế quy trình tinh sạch ở quy mô lớn thì số lượng các bước, và sự thu hồi sản phẩm ở mỗi bước đã ảnh hưởng quan trọng lên hiệu suất toàn bộ (overall yield) của sản phẩm, như trình bày ở hình 6.7. Sự thu hồi đặc trưng của một bước sắc ký là trong khoảng 80% và 90%, vì sự tinh sạch phức tạp đòi hỏi nhiều bước do đó sản lượng toàn bộ nhiều khi chỉ bằng 10% của nguyên liệu khởi đầu. Điều này không thành vấn đề ở trường hợp tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm, nhưng nếu tinh sạch ở quy mô lớn thì đó là vấn đề rất quan trọng cần quan tâm để tối ưu toàn bộ quá trình từ hệ thống biểu hiện hoặc sự lên men đến bước tinh sạch cuối cùng, để giảm thiểu số bước tinh sạch được yêu cầu.
1. Thu hồi protein/enzyme
Sự thu hồi và tinh sạch các protein/enzyme cũng quan trọng như các giai đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein/enzyme. Trong phần sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein/enzyme.
1.1. Thu hồi các protein/enzyme ngoại bào
Các protein/enzyme ngoại bào tương đối dễ thu hồi và tinh sạch. Tế bào và nồng độ của dung dịch hoạt động được loại bỏ một cách đơn giản, và có thể cung cấp trực tiếp protein/enzyme thô thích hợp cho một số ứng dụng.
Dung dịch protein/enzyme tương đối sạch có thể thu được bằng cách cho các nuôi cấy sinh trưởng trên môi trường đơn giản có thành phần xác định. Các bước thu hồi và tinh sạch giống như các bước đã dùng cho protein/enzyme nội bào sau khi phá vỡ tế bào.
1.2. Thu hồi các protein/enzyme nội bào
Để tách chiết các protein/enzyme nội bào của các nguồn động-thực vật, mô phải được phá vỡ để giải phóng chúng.
1.2.1. Phá vỡ tế bào
a. Nguyên lý chung
Các chất tẩy hoặc tác nhân hoạt động bề mặt được dùng để tách enzyme đang liên kết với màng.
Làm khô mô là phương pháp thuận lợi để ổn định và phá vỡ tế bào động vật và thực vật. Phương pháp đông khô không thích hợp để phá vỡ mô nhưng tránh được sự đứt gãy protein, mặc dù nó vô cùng đắt trong sản xuất quy ở mô lớn. Mô có thể được làm khô trong điều kiện chân không hoặc trong không khí, hoặc kết tủa bằng dung môi trộn với nước. Sau đó, thu dịch chiết enzyme từ các nguyên liệu khô bằng cách hydrate hóa trở lại nguyên liệu trong một dung dịch đệm thích hợp. Phương pháp đông lạnh đơn giản cũng có tác dụng phá vỡ một ít mô, mặc dù đây là phương pháp không thích hợp cho việc tăng quy mô sản xuất.
Một số nguyên liệu động-thực vật cần có quá trình đồng hóa, sao cho mô được phá thành những mảnh nhỏ và trộn lẫn với nhau, sau đó sử dụng phương pháp cơ học để phá vỡ tế bào. Một khi enzyme được hòa tan, các vỏ tế bào chết được loại bỏ dễ dàng bằng phương pháp lọc. Ly tâm tốc độ thấp cũng có thể được sử dụng. Ở một số mô có sự hiện diện của chất béo, việc loại bỏ lớp chất béo bằng ly tâm gặp nhiều khó khăn. Các chất béo chỉ được loại bỏ dễ dàng bằng tách chiết dung môi; kết tủa acetone là phương thức thích hợp để tách protein ra khỏi các nguyên liệu lipid. Một phương thức khác là các dung môi trộn nước như hexane, cũng có thể được sử dụng.
Phá vỡ các tế bào vi sinh vật thường gặp nhiều khó khăn hơn các tế bào động vật và thực vật. Các tế bào vi sinh vật thường dai hơn và có kích thước nhỏ (khoảng 0,2-10 μm), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt. Nhiều enzyme từ nấm men và các vi khuẩn Gram âm có thể được chiết bằng cách dùng các dung môi không trộn nước, như toluen hoặc chloroform, có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng enzyme. Các dung môi hòa tan nước, như ethanol và 2-propanol, được dùng để tách chiết enzyme từ khoảng gian bào, nhưng sử dụng các dung môi này đòi hỏi mức độ an toàn cao trong sản xuất ở quy mô lớn. Các chất tẩy thích hợp có thể được dùng để tách chiết các phân tử enzyme nhỏ (trọng lượng phân tử dưới 70.000).
Trong một số trường hợp enzyme ổn định ở giá trị pH cao, có thể sử dụng dung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn được phân giải bằng lysozyme, tuy nhiên giá thành của enzyme này là rất cao. Tương tự, nấm men có thể được phân giải bằng β-glucanase. Hiện tượng tự phân giải có thể xuất hiện trong nấm men, nhưng cần có thời gian dài vì thế sẽ gây khó khăn khi điều chỉnh hoặc tối ưu quá trình lên men.
Các tế bào vi sinh vật có thể được phá vỡ dễ dàng hơn bằng các phương thức vật lý. Siêu âm là kỹ thuật thích hợp và rất hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng khó ứng dụng ở quy mô sản xuất lớn. Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao để đẩy nguyên liệu (dịch huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm đông ở -20oC) qua các lỗ hẹp của máy nén thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá. Phương pháp này có thể sử dụng để phá vỡ các tế bào nuôi cấy ở quy mô lớn 100-1000 L/giờ. Nhiều loại tế bào có thể bị phá vỡ bằng khuấy (rung) nhanh hoặc trộn lẫn với các hạt thuỷ tinh nhỏ hoặc các hạt gốm (ceramic). Ở quy mô phòng thí nghiệm, phương thức này rất thích hợp. Ở quy mô sản xuất lớn người ta sử dụng phương pháp nghiền bằng quả cầu thép. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme phụ thuộc vào vận tốc lắc và kích thước của các loại hạt cũng như đường kính của thiết bị. Với cùng một thể tích hạt thì sử dụng một lượng lớn các hạt nhỏ sẽ hiệu quả hơn một lượng tương đối nhỏ các hạt lớn, vì nó làm tăng sự va chạm giữa các hạt và các tế bào.
Có ba phương pháp chính để giải phóng các protein nội bào khỏi vi sinh vật đó là phương pháp enzyme, hóa học và vật lý. Tuy nhiên, không phải tất cả các kỹ thuật có sẵn là thích hợp để sử dụng trên quy mô lớn. Ở quy mô lớn, người ta thường gặp khó khăn trong việc thiết kế công suất cần thiết cho thể tích lớn và loại bỏ nhiệt được sinh ra trong quá trình phá vỡ tế bào.
b. Các phương pháp enzyme
Lysozyme, một enzyme được sản xuất thương mại từ lòng trắng trứng gà, thủy phân các liên kết β-1,4-glycosidic trong mucopeptide12 của thành tế bào vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram dương phụ thuộc vào mucopeptide của thành tế bào để trở nên rắn chắc dễ bị tổn thương nhất, nhưng sự đứt gãy cuối cùng của thành tế bào phụ thuộc vào hiệu quả thẩm thấu của đệm dịch huyền phù một khi thành tế bào bị cắt gãy. Khi phân giải của vi khuẩn Gram âm, ít khi người ta sử dụng một mình lysozyme, mà thường bổ sung thêm EDTA để tạo chelatevới các ion kim loại sẽ dễ dàng làm tan tế bào (lysis). Mặc dù quá trình thao tác đơn giản và nhẹ nhàng, nhưng kỹ thuật này không được sử dụng cho việc tách chiết ở quy mô lớn các enzyme của vi khuẩn, có lẽ do giá thành tương đối cao của lysoyme và khả năng đưa vào các tác nhân gây nhiễm bẩn. Chỉ có trường hợp người ta dùng lysozyme ở quy mô lớn là để giải phóng aryl acylamidase Pseudomonas fluorescens.
c. Các phương pháp hóa học để phân giải tế bào
+ Xử lý kiềm
Xử lý bằng kiềm đã được sử dụng thành công trong tách chiết ở quy mô nhỏ và lớn các protein vi khuẩn. Ví dụ, enzyme trị liệu, L-asparaginase, có thể được giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào ở pH 11.0-12.5 trong 20 phút. Thành công của phương pháp này là nhờ vào khả năng ổn định của sản phẩm mong muốn. Giá trị pH cao có thể làm bất hoạt protease.
+ Chất tẩy rửa
Các chất tẩy, hoặc ion ví dụ như sodium lauryl sulphate hay còn gọi là sodium dodecyl sulfate, sodium cholate (anion) và cetyl trimethyl ammonium bromide (cation) hoặc không phải ion như Trixton X-100 hoặc X-450, hoặc Tween, được dùng để phân giải tế bào, thường có phối hợp với lysozyme. Các chất tẩy ion có hoạt tính mạnh hơn các chất tẩy không phải ion, và có thể dẫn đến sự biến tính của nhiều protein. Sự hiện diện của các chất tẩy cũng có thể ảnh hưởng đến các bước tinh sạch tiếp theo, đặc biệt kết tủa muối. Điều
12 Mucopeptide: dị polymer đại phân tử chứa hai loại đường amin và một số amino acid. Mucopeptide được thấy gắn liền với thành tế bào của prokaryote. này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion hoặc siêu lọc.
d. Các phương pháp vật lý để phân giải tế bào
+ Shock thẩm thấu
Shock thẩm thấu có thể được dùng để giải phóng enzyme và protein khỏi khoảng gian bào của đa số vi khuẩn Gram âm. Phương pháp này bao gồm rửa tế bào trong dung dịch đệm để làm sạch chúng khỏi môi trường dinh dưỡng, và sau đó tạo dịch huyền phù trong sucrose 20% được dùng làm đệm. Sau khi cho phép cân bằng, tế bào được thu hoạch và tái huyền phù nhanh trong nước ở khoảng 4oC. Chỉ khoảng 4-8% protein tổng số của vi khuẩn được giải phóng bởi shock thẩm thấu, và nếu enzyme mong muốn được định vị trong vùng gian bào, thì nó có thể sản xuất gấp 14-20 lần và rất tinh sạch so với các kỹ thuật tách chiết khác. Ưu điểm chính của shock thẩm thấu là tăng một lượng lớn trong thể tích xảy ra.
+ Nghiền
Trước đây kỹ thuật này có nhiều hạn chế khi nghiền hỗn hợp nhão của tế bào trong cối với bột gây xướt, như là bông thuỷ tinh, alumina hoặc đất tảo cát (kieselguhr). Sau đó, người ta đã phát triển bằng cách sử dụng các máy nghiền ẩm. Một sản phẩm đặc trưng, Dynomill (WA Bachofen, Switzerland) có thể được dùng để giải phóng protein khỏi rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Nó bao gồm một cái buồng chứa các hạt thủy tinh và đa số được cố định và các đĩa khuấy quay tròn. Dịch huyền phù tế bào được bơm vào buồng, và khuấy nhanh đủ để phá vỡ thậm chí cả các tế bào vi khuẩn dai nhất. Buồng phân hủy phải được làm lạnh để loại bỏ sự sinh nhiệt. Một mô hình quy mô phòng thí nghiệm, với buồng 600 mL có thể thực hiện tới 5 kg vi khuẩn trên một giờ, và các mô hình ở quy mô sản xuất là thích hợp với buồng có thể tích lên tới 250 lít.
Nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tỷ lệ tế bào bị phá vỡ, như là kích thước và nồng độ của các hạt thủy tinh, loại, nồng độ và tuổi của tế bào, tiền xử lý hoá chất, tốc độ khuấy, tốc độ dòng chảy qua buồng, nhiệt độ, và sự sắp xếp của các đĩa khuấy, và những yếu tố này đã được khảo sát ở nấm men và vi khuẩn.
+ Trượt rắn
Phương pháp phá vỡ tế bào bằng trượt rắn đã được dùng khá lâu ở quy mô nhỏ. Nguyên tắc của phương pháp này là đẩy nguyên liệu tế bào đã đông lạnh qua một lỗ hẹp ở một áp suất cao và một nhiệt độ thoát ra ngoài khoảng –20oC. Phương pháp này ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp, do nó không thể áp dụng một lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ tế bào.
+ Trượt lỏng
Trượt lỏng là nguyên tắc chọn lựa để phá vỡ các tế bào vi sinh vật ở quy mô lớn, được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong cả hai các quá trình công nghiệp và nghiên cứu. Phương pháp này đặc biệt thuận lợi cho phá vỡ vi khuẩn và nấm men.
Tương tự như phương pháp trượt rắn, các tế bào trong dịch huyền phù được chuyển qua một lỗ được dưới một áp suất cao. Trường hợp ở ở quy mô nhỏ hơn, người ta sử dụng thiết bị French Press. Ở quy mô lớn thường dùng thiết bị đồng hoá (homogenizer) là loại được phát triển để tạo thể sữa trong công nghiệp bơ sữa. Nhiệt độ tăng lên ít nhất 10oC trong một rãnh đơn là thường xảy ra vì thế cần phải làm lạnh dịch huyền phù tế bào trước khi đồng hóa. Thiết bị đồng hóa trượt lỏng thường được hoạt động ở độ ẩm tế bào khoảng 20%.
Trong trường hợp quy mô lớn thì thiết bị đồng hóa Manton-Gaulin (APV Ltd. Crawley, UK) được sử dụng rông rãi nhất. Nó bao gồm một máy bơm kiểu piston có một van thoát hơi được hạn chế, có thể điều chỉnh áp suất hoạt động cần thiết, tới 95 MPa. Thiết bị đồng hóa Manton-Gaulin (Hình 6.8) loại nhỏ nhất, 15-8TA, có thể đưa nguyên liệu vào khoảng 50 lít/giờ ở áp suất 55 MPa. Một phiên bản lớn hơn, loại MC-4, có thể đưa nguyên liệu vào 300 lít/giờ cũng ở áp suất 55 MPa.
Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein phụ thuộc vào một số nhân tố như: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng độ và tiền xử lý (chẳng hạn đông lạnh, vì các tế bào vi sinh vật thường dễ vỡ hơn nhiều nếu chúng được làm lạnh trước)... Người ta cũng nhận thấy rằng sự hiện diện của các thể vùi13 giúp cho các tế bào E. coli dễ dàng bị phá vỡ hơn.
1.2.2. Phân lập các enzyme hòa tan
Phương thức quan trọng để phân tách enzyme hòa tan nhanh và hiệu quả sau khi phá vỡ tế bào là làm lạnh, dùng dung dịch đệm thích hợp, và có sự hiện diện của các tác nhân bảo vệ enzyme như mercapthoethanol (cần thiết để ổn định một số dung dịch enzyme).
Thường các nhân tố ức chế protein phải được bổ sung để làm giảm ảnh hưởng phá huỷ của protease. Các enzyme hòa tan có thể được thu thập bằng phương pháp lọc qua màng hoặc bằng cách ly tâm. Phương pháp sau tương đối dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với các lực ly tâm tốc độ cao. Các lực g cao như thế không thể đạt được ở các thiết bị quy mô sản xuất lớn. Các máy ly tâm lớn thường được cấu tạo từ các hợp kim titanium đắt tiền để chịu đựng các lực g cao, nhưng mặc dù thế chỉ có thể thu được các lực g không cao lắm mà thôi. Để khắc phục điều này, các chất kết tủa nucleoprotein và protein, như polyethyleneimine, được bổ sung vào các chất đồng hóa tế bào để kết bông các nguyên liệu không mong muốn và giảm thời gian lắng xuống nhanh hơn.
Sử dụng phương pháp lọc như dùng đất diatomit (diatomaceous earth), có thể là biện pháp thích hợp để thu được các enzyme hòa tan và phát triển dễ dàng ở quy mô lớn. Các phương thức bổ sung được sử dụng để tăng tốc độ lọc. Thông thường một vài tác nhân kết tủa có thể được cùng sử dụng để giảm các bước tiếp theo của quá trình. Các phương tiện lọc trợ giúp có thể được dùng để thu thập các tế bào hoàn chỉnh và cung cấp một kỹ thuật phá vỡ tế bào mà không dựa vào các thiết bị đồng hóa cơ học. Ví dụ: các tế bào trong hỗn hợp lọc có thể được phân giải hóa học, enzyme hoặc phương thức vật lý bằng cách khuấy nhờ khả năng gây xướt tế bào của diatomit. Các enzyme hòa tan được giải phóng có thể được thu thập thuận lợi bằng phương pháp lọc đơn giản.
Siêu lọc là công nghệ rất toàn diện, dễ dàng cho quy mô lớn và, với sự chọn lựa chính xác độ xốp của màng các enzyme có thể được thu thập một cách chọn lọc theo phạm vi trọng lượng phân tử của chúng. Đĩa và khung, và các sợi rỗng (hollow fibres) được sử dụng trong một thời gian dài. Các màng ceramic hiện nay trở nên phổ biến hơn do đặc điểm dễ làm sạch và dễ khử trùng của chúng, vì chúng có thể chịu được nhiệt độ cao dưới các điều kiện chất tẩy và độ kiềm cao.
Thường thì dung dịch enzyme hòa tan không yêu cầu xử lý thêm nữa ngoại trừ nồng độ, hoặc dưới áp suất giảm hoặc bằng phương pháp lọc màng, để sản xuất một dung dịch protein được cô đặc (10-50% chất rắn). Các chất ổn định như ammonium sulphate có thể được bổ sung nếu cần thiết. Các tá dược như lactose, dextrin cũng có thể được bổ sung với vai trò là các chất ổn định enzyme.
2. Tinh sạch bước đầu
Tinh sạch enzyme là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những enzyme có giá trị ứng dụng cao. Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự chọn lựa kỹ thuật phân tách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn. Môi trường phân tách giống nhau thường được sử dụng trong các kỹ thuật khác nhau, nghĩa là sắc ký trao đổi ion được thực hành tốt nhất khi tách rửa dần dần từ cột ở quy mô nhỏ hơn, và bằng sự hấp phụ/tách rửa từng mẻ ở quy mô lớn hơn.
2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào
Sau khi phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch enzyme nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong phân lập enzyme, và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Nhiều quy trình có bổ sung một lượng nhỏ DNase ở giai đoạn này, để phá vỡ thêm các chuỗi DNA có thể làm cho dịch chiết trở thành dạng sệt (gelatinous).
2.2. Ly tâm mẻ
Ly tâm mẻ thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng từ nhỏ hơn 1 mL đến một vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm tương đối lớn lên tới 100.000 × g (hằng số hấp dẫn). Tuy nhiên, để loại bỏ các tế bào vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein, thì lực ly tâm đạt tới 20.000 × g là thích hợp. Nhiều thiết bị ly tâm loại này, thích hợp cho các quá trình tách chiết ở quy mô trung bình.
2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục
Do thể tích lớn của chất lỏng cần phải được thao tác bằng tay ở thời điểm bắt đầu của quá trình tinh sạch enzyme ở quy mô lớn, người ta thường dùng phương pháp ly tâm dòng chảy liên tục để loại bỏ các chất dạng hạt. Có ba loại ly tâm chính là thích hợp hơn cả là: ly tâm thùng rổng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng (multi-chamber) hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng (basket).
- Ly tâm thùng rổng có một rotor hình ống cung cấp một đường chảy dài cho dịch chiết được bơm vào trong đáy và chảy lên qua thùng. Chất lắng bị bắn vào thành của thùng, và dịch chiết được gạn sẽ chuyển lên để ra khỏi thùng vào trong bình thu. Khi ly tâm tiếp tục, đường kính thực tế của thùng giảm xuống, vì thế nó làm giảm đường lắng xuống và lực ly tâm có thể được áp dụng. Tốc độ dòng chảy phải được xác định theo kinh nghiệm vì nó rất khác nhau giữa các loại dịch chiết, nhưng tốc độ dòng chảy thích hợp cho các máy lớn là khoảng 60 lít/giờ.
- Ly tâm đĩa cung cấp các phương thức lý tưởng để gạn lọc các dịch chiết thô, và trong nhiều trường hợp chất lắng xuống có thể chảy ra ngoài mà không làm gián đoạn quá trình ly tâm. Thùng chứa một series đĩa xung quanh một hình nón ở giữa. Khi dịch chiết đi vào, chất hạt bị bắn ra ngoài, chạm vào các đĩa hình nón và chất lắng tập trung trên thành của thùng. Phương pháp này cung cấp một đường chảy không đổi, vì thế hiệu suất ly tâm ít bị hao hụt. Nhược điểm của kiểu ly tâm này là có hao hụt một ít sản phẩm trong suốt quá trình chảy ra ngoài. Ly tâm đĩa có thể đạt tới một lực ly tâm RCF (rotational centrifugal force) khoảng 8.000 × g và có sức chứa lên đến 20 kg chất lắng.
- Ly tâm thúng được thiết kế để hoạt động ở các lực ly tâm thấp hơn nhiều, có thể chỉ 1.000 rpm, về cơ bản đó là các bộ lọc ly tâm. Thùng được đục thủng lỗ và thường được lót bằng vải lọc. Ứng dụng chính của ly tâm này là để thu thập các hạt nguyên liệu lớn; trong phạm vi tinh sạch enzyme thì đó là các nguyên liệu trao đổi ion được dùng cho hấp phụ theo mẻ của protein mong muốn.
2.4. Lọc bằng màng
Lọc là một phương pháp khác để gạn các dịch chiết tế bào. Tuy nhiên, dịch nuôi cấy vi sinh vật và các dịch chiết có khuynh hướng trở thành dạng sệt tự nhiên thường khó khăn khi lọc bằng các phương pháp truyền thống, trừ khi diện tích màng lọc được sử dụng là rất lớn.
Có thể khắc phục điều này bằng cách dùng phương pháp lọc dòng chảy ngang (cross-flow) hoặc tiếp tuyến (tangential). Trong phương pháp này dịch chiết chảy ở góc phải theo hướng lọc, và sử dụng tốc độ dòng chảy cao có khuynh hướng giảm sự tắc nghẽn bằng các hoạt động tự làm sạch. Chẳng hạn để thu hồi ở quy mô lớn L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi người ta sử dụng một màng lọc có diện tích 1 m2 dùng để thu hoạch tế bào từ 100 lít của chất lỏng nuôi cấy trong 2,5 giờ lúc đó nồng độ các chất rắn ở phần được giữ lại trên màng tăng lên từ 0,55%-22% trọng lượng khô. Sau đó, một màng giống như thế được dùng để gạn lọc dịch chiết thu được bằng phân giải kiềm các vi khuẩn này. Các số liệu này đã chỉ ra rằng để thu hoach tế bào từ 500 lít nuôi cấy trong 2,5 giờ đòi hỏi màng 7,5 m2, và chi phí cho quá trình này ít hơn so với phương pháp ly tâm.
Do các giới hạn của ly tâm quy mô lớn nên hai kỹ thuật thường được phối hợp để đảm bảo rằng dịch chiết là thật sự sạch cho bước sắc ký tiếp theo.
3. Hệ thống phân chia hai pha nước
Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha nước (aqueous two-phase separation). Các hệ thống hai pha nước đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia của các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Sự phân chia chính xác của một protein tùy thuộc vào các thông số như trọng lượng phân tử và điện tích của chúng, nồng độ và trọng lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các muối đa trị như phosphate hoặc sulfate. Các điều kiện tối ưu cần thiết cho một protein đặc biệt được tìm thấy theo kinh nghiệm. Mặc dù, các điều kiện cần thiết để đạt được sự phân chia vừa ý thường có thể được định nghĩa chính xác, cơ chế của sự phân chia hai pha hiện nay chưa được hiểu đầy đủ.
Các pha có thể phân chia trong một thùng lắng, nhưng để phân chia nhanh và hiệu quả hơn có thể sử dụng phối hợp với phương pháp ly tâm. Vì phân chia các chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân chia các chất rắn ra khỏi các chất lỏng trên quy mô lớn, nên phương thức này có thể được dùng để hỗ trợ cho quá trình tinh sạch enzyme ở quy mô lớn. Mặc dù giá thành khá thấp của hệ thống PEG/muối đã làm cho nó trở nên thích hợp hơn cho việc sử dụng ở quy mô lớn, nhưng hệ thống PEG/dextran (dextran có giá thành khá cao) phân chia hiệu quả hơn cũng là một phương pháp kinh tế nếu so sánh với các phương pháp tinh sạch khác. Sử dụng hệ thống phân chia hai pha nước không bị hạn chế đối với các nguyên liệu có nguồn gốc vi sinh vật, và phương pháp này được dùng thành công để phân lập các nguyên liệu khỏi cả hai nguồn thực vật và động vật, bao gồm cả α-L-antitrypsin của người được biểu hiện trong sữa chuyển gen. Trong trường hợp này độ tinh sạch khởi đầu tương đối cao của protein, tức là sau khi phân chia hai pha đơn thì protein mong muốn được tinh sạch tới 73%.
Sự phân chia hai pha nước có thể được thích nghi để cung cấp sự phân chia đặc trưng sinh học bằng cách gắn các phối tử vào polymer để thay đổi sự phân chia của protein. Tất cả các polymer tạo pha có thể có các phối tử được gắn đồng hóa trị vào chúng, và một phạm vi rộng của các phối tử như thế đã được quan sát. Do liên kết hóa học đơn giản của chúng, các chất nhuộm phản ứng được sử dụng thường xuyên như các phối tử. Ngoài các thuốc nhuộm phản ứng, một số phối tử khác cũng đã được khảo sát. Những phối tử này bao gồm các cofactor, như pyridine nucleotide được sử dụng thành công trong phân chia ái lực các dehydrogenase.
Ở quy mô quy trình lớn, sự tinh sạch ái lực đã được sử dụng cho tinh sạch formate dehydrogenase khỏi 10 kg nấm men Candida bodinii, bằng cách dùng thuốc nhuộm triazine, Procion Red HE-3B, được bất động trên PEG.
Mặc dù phân chia hai pha nước là phương pháp có thể phát triển dễ dàng ở quy mô lớn để sản xuất, nhưng hình như nó không thường xuyên được dùng để tinh sạch ở quy mô công nghiệp.
4. Các phương pháp kết tủa
Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch enzyme. Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc phối hợp, với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và polyallylamine, hoặc các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và acetone.
Streptomycin sulphate, plyethyleneimine và các polyamine khác có thể kết tủa các chất có tính chất acid như nucleic acid và các nucleoprotein. Ammonium sulphate và các dung môi hữu cơ có thể kết tủa một cách chọn lọc enzyme mong muốn với hoạt tính thu hồi từ 80-90%..
Kết tủa đơn giản cũng có thể giúp loại bỏ protease. Lợi ích chính của bước này là làm giảm thể tích hoạt động tổng số, thường bằng một thừa số của 20. Do đó sẽ giảm một cách ý nghĩa thể tích của nhựa trao đổi ion. Thay đổi pH và nhiệt độ cũng có thể tạo ra kết tủa chọn lọc và loại bỏ các protein enzyme không mong muốn.
Sự phân chia chất lỏng-chất lỏng bằng polyethylene glycol, dextran hoặc polyamines có thể tạo ra các pha phân tách chất lỏng trong đó các protein/enzyme mong muốn có thể được tập trung lại. Xử lý kiểu này cho phép thu hồi lại các polymers để sử dụng. Các phương pháp này được ứng dụng dễ dàng đối với toàn bộ dịch nuôi cấy có protein/enzyme hòa tan (enzyme ngoại bào).
4.1. Kết tủa bằng ammonium
Xử lý muối các protein đã được dùng trong nhiều năm, và đạt được cả hai mục đích tinh sạch và cô đặc. Loại muối được sử dụng phổ biến nhất là ammonium sulfate, do khả năng hòa tan của nó, không có độc tính cho hầu hết các enzyme, và giá thành thấp.
Kết tủa protein bằng muối phụ thuộc vào nhiều nhân tố như: pH, nhiệt độ, nồng độ protein, và loại muối được sử dụng. Nồng độ protein là thông số đặc biệt quan trọng khi tăng quy mô, bởi vì hầu hết sự tinh sạch ở quy mô lớn được tiến hành ở các nồng độ protein cao hơn sự tinh sạch ở quy mô phòng thí nghiệm. Điều này có thể ảnh hưởng sâu sắc lên nồng độ của muối cần thiết để kết tủa protein mong muốn.
4.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ
Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch nước làm giảm khả năng hòa tan của protein do giảm hằng số điện môi của môi trường. Các dung môi hữu cơ khác nhau được dùng để kết tủa protein, kết tủa bằng ethanol, acetone, và propan-2-ol đang là quan trọng nhất. Bởi vì các protein bị biến tính bằng các dung môi hữu cơ nên cần thiết làm việc ở nhiệt độ dưới 0oC.
Do bản chất dễ cháy của các dung môi hữu cơ nên cần phải sử dụng thiết bị chịu lửa, và giá thành cao, liên kết với một sự chọn lọc thấp, các dung môi hữu cơ thường không được dùng trong tinh sạch enzyme ở quy mô lớn. Ngoại trừ trường hợp xử lý máu (blood processing field), trong đó kết tủa ethanol là phương pháp chính để tinh sạch albumin; và trên thực tế phương pháp này đang được phát triển trong một hệ thống được điều khiển tự động bằng computer.
4.3. Kết tủa bằng các polymer trọng lượng phân tử cao
Các chất kết tủa hữu cơ khác có thể được dùng để phân đoạn các protein là các polymer hòa tan nước như PEG. Chất này có ưu điểm là không có độc tính, không dễ cháy và không gây biến tính các protein. Nó được dùng chủ yếu trong lĩnh vực xử lý máu.
4.4. Kết tủa bằng nhiệt
Khi protein đủ mạnh khó bị biến tính, thì xử lý nhiệt có thể cung cấp một mức độ tinh sạch cao được xem như một bước đầu tiên. Trong quy mô lớn, ví dụ: 55% protein không mong muốn được loại bỏ trong một bước riêng rẽ bằng cách làm nóng dịch chiết E. coli mang protein A của Staphylococcus tái tổ hợp ở 80oC trong 10 phút. Nếu protein tái tổ hợp được tinh sạch khỏi một cơ thể ưa nhiệt thì kết quả của xử lý nhiệt đầu tiên có thể là hiệu quả hơn nhiều: khi dịch chiết E. coli chứa malate dehydrogenase tái tổ hợp Thermus aquaticus được làm nóng tới 80oC trong 20 phút enzyme trong thể nổi là khoảng 90% thuần nhất.
5. Các phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tích sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực hành chuẩn ở phòng thí nghiệm trong nhiều năm. Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ/giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Sắc ký chỉ là phương pháp với khả năng chọn lọc được yêu cầu để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95%.
Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký được sử dụng phổ biến, bao gồm trao đổi ion, tương tác kỵ nước, ngăn chận kích thước, ái lực và ái lực giả (sắc ký với phối tử là thuốc nhuộm). Bước làm sạch thêm có thể được thực hiện bằng cách dùng sắc ký ngăn chận kích thước. Tuy nhiên, kỹ thuật này khó thực hiện ở quy mô lớn, và thường không cần thiết phải tinh sạch enzyme tới 99%. Nếu cần mức độ tinh sạch lớn hơn 95% có thể tiến hành sắc ký hấp phụ/khử hấp phụ thêm một lần nữa sẽ giúp thu được enzyme tinh sạch hơn. Các kỹ thuật tinh sạch như thế không làm tăng hoạt tính của enzyme, đây là một yếu tố phải được xem xét khi kết tủa enzyme có độ tinh khiết cao.
Các kết tủa enzyme tinh sạch cao nói chung được đông khô để bảo quản và vận chuyển. Các tác nhân bảo vệ lạnh đông polyhydroxy (cryoprotectants), các dung dịch đệm, các chất khử và các chất kháng khuẩn có thể được bổ sung nếu cần thiết.
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
Nguyễn Hoàng Lộc