Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào.
1. Enzyme hạn chế
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction enzyme) của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn. Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của
enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bới các enzyme hạn chế. Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA (Hình 2.3). Có hơn 500 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 loài vi sinh vật. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau
- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng.
- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le
(đầu kết dính). Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích
thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector
mang các đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
2. Các vector được dùng để tạo dòng các đoạn DNA
Các đoạn DNA thu được từ phản ứng cắt hạn chế được gắn đồng hóa trị in vitro vào vector tạo dòng bằng cách dùng enzyme gắn DNA ligase. Trước khi gắn, vector được cắt ra ở một vị trí đơn, thông thường là cùng với enzyme được dùng để cắt DNA nguồn, nhằm tạo các đầu kết dính bổ trợ cho các đầu của đoạn DNA chèn vào (DNA ngoại lai). Một đôi khi, vector và DNA nguồn được cắt với tổ hợp hai enzyme khác nhau để ngăn cản mỗi loại phân tử tự gắn lại. Sự tự tái tạo lại vòng của vector cũng có thể giảm thiểu bằng cách xử lý với enzyme alkaline phosphatase để loại nhóm 5’-phosphate khỏi các đầu của vector. Một số lớn các vector tạo dòng được phát triển cho việc xây dựng các thư viện DNA, chọn lựa vector nào phụ thuộc vào phạm vi kích thước của các đoạn DNA được tạo dòng, và các ứng dụng
tiếp theo. Trong thực tế, các đoạn DNA được gắn với nhau để tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp thường không phải là các đoạn ngẫu nhiên của genomic DNA, mà thay vào đó là một trong các đoạn DNA mang một gen từ sinh vật eukaryote hoặc vi khuẩn và một đoạn DNA khác thường là một phân tử vector (vector molecule) hoạt động như là một vật truyền để chuyển gen quan tâm vào trong một vi khuẩn hoặc một tế bào eukaryote. Hai loại vector được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (bacteriophage hoặc phage).
2.1. Plasmid vector
Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân, được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1- ≥ 200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid dùng làm vector tạo dòng có các đặc điểm sau: Kích thước tương đối nhỏ, mang một hoặc nhiều gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) cho phép xác định các nhân tố biến nạp và duy trì plasmid trong quần thể vi khuẩn, chứa các vị trí nhận biết đơn cho một hoặc nhiều enzyme hạn chế. Các plasmid được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là các plasmid đa năng (polycloning plasmid) và chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba. Để tiện cho việc sử dụng nhiều loại enzyme hạn chế khác nhau, nhiều trình tự nhận biết của chúng được xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker (vùng đa nối) hay multiple cloning sites (các vị trí tạo dòng). Các plasmid vi khuẩn có thể chứa đoạn DNA ngoại lai khoảng 3-10 kb. Có ba nhóm plasmid thông dụng hiện đang được bán rộng rãir trên thị trường như:
- Nhóm các plasmid pUC: Kích thước khoảng 2.600 bp, mang gen Amp và gen lacZ, xen vào giữa gen lacZ là polylinker (Hình 2.4). Các thành viên của nhóm này chỉ khác nhau do độ dài và chiều của polylinker. Các ưu điểm của nhóm này: Kích thước2nhỏ, vùng polylinker cho phép chèn vào gần như bất kỳ một trình tự DNA lạ nào, sự có mặt của gen lacZ rất thuận lợi cho việc phát hiện vector tái tổ hợp.
- Nhóm các plasmid pGEM: Kích thước khoảng 3.000 bp, mang gen Amp , gen lacZ, polylinker và promoter đặc trưng cho các RNA polymerase (SP6, T7) ở hai bên vùng polylinker cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector thành nhiều RNA Các RNA này thường dùng làm probe hay dùng
trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng củaRNA. Mang hai đầu T, thích hợp cho gắn các sản phẩm PCR do chúng có mang hai đầu A.
- Nhóm các plasmid pBluescript: Kích thước khoảng 3.000 bp, các plasmid này kết hợp được tất
cả những ưu điểm của các nhóm vừa kể và được xem là nhóm có tiềm năng lớn nhất hiện nay
Về nguyên tắc, DNA plasmid bị cắt bởi enzyme hạn chế và gắn in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo ra các plasmid tái tổ hợp, sau đó chúng được dùng để biến nạp vào vi khuẩn. Khó khăn lớn nhất là phân biệt giữa các plasmid chứa các đoạn DNA ngoại lai-thể tái tổ hợp (recombinant) và các phân tử DNA vector đã tái tạo lại vòng (recircularization). Sự tái tạo lại vòng của plasmid có thể được hạn chế bằng cách điều chỉnh nồng độ DNA ngoại lai và DNA vector trong phản ứng gắn ligation). pBluescript SK (+/-). Vector này mang vùng tạo dòng ở vị trí từ 657-759 trên gen lacZ, và các cặp primer khác nhau dùng cho phân tích trình tự đoạn DNA ngoại lai.
2.2. Bacteriophage λ vector
Có hai loại bacteriophage thường được sử dụng là λ và M13, trong chương này chúng tôi chỉ trình bày loại phổ biến hơn là bacteriophage λ. Bacteriophage λ là một virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kb, DNA của nó ở dạng phân tử mạch thẳng có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (được dùng làm đầu cos). Sau khi xâm nhiễm vào vi khuẩn vật chủ, DNA tạo vòng ngay lập tức bằng cách ghép hai đầu kết dính cos nhờ DNA ligase của vật chủ (Hình 2.7). Các giai đoạn tiếp theo có thể dẫn đến việc hoặc làm tan (lysis) tế bào vật chủ (bao gồm việc sản xuất và giải phóng các phage thế hệ con) hoặc là gây ra hiện tượng tiềm tan (lysogeny) (trong giai đoạn này λ DNA hợp nhất vào trong chromosome của vật chủ). Các phage có khả năng thực hiện tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho (donor) sang tế bào nhận (recipient). Vector phage λ được sử dụng rộng rãi để xây dựng thư viện gen (gene library), vì nó mang được đoạn DNA ngoại lai lớn hơn (15-23 kb) so với plasmid, dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích. Ưu điểm nổi bật của các phage λ là chúng có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn với một hiệu quả cao hơn nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn bằng biến nạp. Tuy nhiên các thao tác ban đầu có phức tạp hơn. Trước đây người ta nghĩ rằng việc sử dụng phage λ làm vector là rất bất tiện do DNA của nó quá dài (50 kb), muốn cắt ra nhiều đoạn thì phải có nhiều trình tự cắt. Tuy nhiên, về sau người ta đã phát hiện ở giữa DNA của phage λ có vùng đệm (stuffer) hay còn gọi là vùng trung tâm có chiều dài bằng khoảng 1/3 chiều dài của phage λ, vùng này không quan trọng và nếu cắt nó đi thì vẫn không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage λ trong tế bào vi khuẩn vật chủ và khả năng làm tan tế bào vật chủ của chúng. Vì thế, người ta đã cắt bỏ đoạn stuffer để lắp các đoạn gen ngoại lai vào. Trên vector phage λ người ta cũng đã chọn được các vị trí nhận biết cho các enzyme cắt hạn chế, và xây dựng phương pháp đóng gói in vitro (in vitro packing) để đưa đoạn DNA đã được gắn vào đầu của phage. nhau đã được chỉ ra trên sơ đồ. N, cro, cI: các gen liên quan đến hoạt động điều hòa, miễn dịch tiền phage, siêu nhiễm. O và P: các gen tổng hợp DNA. Q: gen điều hòa chức năng muộn. S và R: các gen phân giải tế bào vật chủ. p : promoter bên trái, p : promoter bên phải.
3. Gắn đoạnDNA vào vector
3.1. Gắn các đoạn cDNA
Có nhiều phương pháp khác nhau được dùng để liên kết cDNA sợi đôi với các plasmid vector, như: Bổ sung các đuôi đồng trùng hợp (homopolymetric tailing) cho cDNA sợi đôi và cho plasmid vector, bổ sung các nhân tố liên kết nhân tạo (linkers và adapter) cho đầu tận cùng của DNA sợi đôi… Ở đây chỉ trình bày các linker và adapter nhân tạo.
3.1.1. Các linker
Các linker chứa một hoặc nhiều vị trí cắt hạn chế cho phép gắn cDNA sợi đôi với các plasmid vector hoặc bacteriophage λ vector. Sợi đôi cDNA được xử lý với DNA polymerase (ví dụ: đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli), enzyme này loại bỏ đầu tận cùng 3’ sợi đơn so le bằng hoạt tính exonucleolytic 3’→ 5’ và lấp đầy các đầu tận cùng 3’-OH bị khuyết bằng hoạt tính trùng hợp (polymerization). Sự phối hợp của các hoạt tính này đã tạo ra các phân tử DNA đầu bằng, sau đó các cDNA này được ủ với các phân tử linker có mặt của enzyme gắn là DNA ligase. Các phân tử DNA sợi đôi mang các đầu dính kết nhân tạo được cắt hạn chế ở vị trí nhận biết trong linker, tinh sạch, và sau đó gắn với vector cũng được cắt bằng enzyme hạn chế tương ứng tạo ra các đầu dính kết tương đồng với các đầu của linker. Có thể hạn chế sự tái tạo lại vòng của plasmid vector (không tái tổ hợp) bằng cách xử lý các vector được cắt bằng alkaline phosphatase trước khi thực hiện phản ứng gắn với cDNA. bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc. Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo. Cuối cùng đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E. coli.
Theo nhập môn công nghệ sinh học của
Nguyễn Hoàng Lộ