2. Dung môi, động vật thực nghiệm và thiết bị
Dung môi dùng để chiết xuất gồm ethanol thực phẩm 96⁰ (Việt Nam) và nước cất.
Động vật thực nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss cả 2 giống, trọng lượng 18–24g và chuột cống trắng chủng Wistar cả hai giống, trọng lượng 200-220g được Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Thiết bị: Thiết bị chiết siêu âm (EnviTech, Việt Nam), máy cô quay dưới áp suất thấp R-210 (Buchi, Thụy Sĩ), cân phân tích AB104-S (Mettler Toledo, Phần Lan), máy đóng nang cứng NJP-260 (ANS, Việt Nam).
Chuồng nuôi chuột điều kiện tiêu chuẩn tại Công ty cổ phần phòng chẩn trị y học cổ truyền Daibio. Kim đầu tù chuyên dụng của Nhật Bản dùng cho chuột uống thuốc, bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ, kính hiển vi CX33 kèm hệ thống camera LP114000A (Olympus, Nhật), máy sinh hóa AU480 (Beckman Coulter, Mỹ) và các dụng cụ thí nghiệm khác.
3. Điều chế cao chiết bằng ethamol 50º và bào chế chế phẩm Ageless Man
Chiết các cao dược liệu theo các phương pháp đã mô tả [12] như sau: Bột nguyên liệu được cho vào túi vải, ngâm chiết trong ethanol 50º. Sau khi ngâm 24 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao chiết. Cao chiết được làm khô dưới áp suất thấp để đạt độ ẩm dưới 15% và bảo quản trong bình thủy tinh ở nhiệt độ phòng.
Mỗi viên nang của chế phẩm Ageless Man No6 được bào chế từ 100mg cao huệ đá lá nhỏ, 50mg nhục thung dung, 50mg ngọc cẩu, 40mg dâm dương hoắc, 68mg hoàng kỳ, 68mg đương quy, 56mg đan sâm, 68mg bạch thược với các tá dược vừa đủ 600mg của viên nang số 0 [12].
4. Nghiên cứu độc tính cấp của chế phẩm Ageless Man No6
Nghiên cứu độc tính cấp theo quy định của OECD và Bộ Y tế ban hành [17-20] được thực hiện trên 60 chuột nhắt trắng chủng Swiss cả 2 giống, khoẻ mạnh với trọng lượng 18–24g được Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn 12 giờ, nước uống tự do. Sau 12 giờ, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con. Các lô thử được cho uống bột chế phẩm viên nang cứng Ageless Man No6 với thể tích 0,2 ml/10g/lần, 3 lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau 3 giờ. Mức liều cho uống ở 6 lô tăng dần từ 5,0g/kgP lên 7,5/kgP; 10,0/kgP; 12,5/kgP; 15,0/kgP và 17,5g/kgP để xác định LD50. Chuột được cho ăn trở lại sau 2 giờ, nước uống bình thường. Theo dõi liên tục trong 4 giờ đầu; các chỉ tiêu và số chuột chết trong 72 giờ đầu theo quy định và tiếp tục theo dõi trong 7 ngày sau khi uống viên nang thử.
5. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của chế phẩm Ageless Man No6
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn theo phương pháp của OECD và Bộ Y tế ban hành [20, 21] trên 32 chuột cống trắng chủng Wistar mỗi giống, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng chọn lựa trong khoảng 200-220g do Viện VSDT TW cung cấp. Chuột thí nghiệm được phân rõ đực cái riêng, chia thành 4 lô (n=8): lô chứng uống 1ml dung môi pha thuốc NaCMC 0,1%/ngày, lô thử liều 1 là 135 mg chế phẩm pha trong CMC-Na 0,1 %/kgP, liều 2 là 270 mg/kgP và liều 3 là 400 mg/kgP (chuyển đổi tương ứng các liều uống dự kiến 2; 4 và 6 viên/ngày/người).
Đánh giá tỷ lệ tăng cân chuột tại thời điểm theo dõi so với khối lượng ban đầu theo công thức:
TNiLj (%) = (mNiLj - mNiL0)/mNiL0 x 10m; trong đó: Ni là thời điểm i = 7, 14 và 28 ngày; Lj là lô chứng (j=0)
và lô liều thử j = 1, 2 và 3; mNiLj là khối lượng chuột cân ở thời điểm Ni và liều Lj.
Thống kê và xử lý số liệu: Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng Trung bình (TB) ± SD (standard deviation). Các thuật toán thống kê t-test để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với *P<0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê.
Tham Khảo:
[1] Li H, Jiang H, Liu J. Traditional Chinese medical therapy for erectile dysfunction. Transl Androl Urol. 2017 Apr;6(2):192-198. doi: 10.21037/tau.2017.03.02. PMID: 28540226; PMCID: PMC5422677.
[2] Wang T, Chen C, Yang M, Deng B, Kirby GM and Zhang X. Cistanche tubulosa ethanol extract mediates rat sex hormone levels by induction of testicularsteroidgenic enzymes. Pharm Biol. 2015; 25:1-7
[3] W. Liu, Z. Xin, H. Xin, Y. Yuan, L. Tian, Y. Guo, Effects of icariin on erectile function and expression of nitric oxide synthase isoforms in castrated rats, Asian J. Androl. 7 (4) (2005) 381 388
[4] Wu ZQ, Chen DL, Lin FH, et al. Effect of bajijiasu isolated from Morinda officinalis F. C. how on sexual function in male mice and its antioxidant protection of human sperm. J. Ethnopharmacol 2015;164:283-92
[5] Hu WL, Hu LQ, Cheng B, et al. Effect of Angelica sinensis on NOS activity in penile tissues of rats after crushing injury to cavernous nerves. Zhonghua Nan Ke Xue 2001;7:29-3
[6] Zhu B, Zhang QL, Hua JW, Cheng WL, Qin LP. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Atractylodes macrocephala Koidz.: A review. J Ethnopharmacol. 2018 Nov 15;226:143-167. doi: 10.1016/j.jep.2018.08.023. Epub 2018 Aug 18. PMID: 30130541
[7 ] Luo Q, Li Z, Huang X, et al. Lycium barbarum polysaccharides: Protective effects against heat-induced damage of rat testes and H2O2-induced DNA damage in mouse testicular cells and beneficial effect on sexual behavior and reproductive function of hemicastrated rats. Life Sci 2006;79:613-21
[8] http://www.qihuang99.com/bbs
[9] Nguyễn Văn Dũng. Đề tài “Nghiên cứu bào chế viên hoàn sâm nhung tán dục đơn và đánh giá hiệu quả điều trị trên bệnh nhân suy giảm số lượng và chất lượng tinh trùng tại Bệnh viện Y học cổ truyền thành phố Đà Nẵng”, Sở Y tế Đà Nẵng, 2017-2018
[10] Wang JS, Dai HH, Zhang KG, Cao KG, Deng S, Bao BH, Feng JL, Meng FC, Li HS, Wang B. Mechanism of Huoxue Tongluo Decoction in treatment of erectile dysfunction caused by ischemic stroke based on network pharmacology. Chin Herb Med. 2021 Apr 30;13 (3):351-358. doi: 10.1016/j.chmed.2021.04.016. PMID: 36118932; PMCID: PMC9476638
[11] Ma K, Zhao F, Ye MY, Zhou K, Huang WJ, Zhao JF, Ma YF, Shou QY, Lv BD. Neuroprotective effect of Hongjing I granules on erectile dysfunction in a rat model of bilateral cavernous nerve injury. Biomed Pharmacother. 2020 Oct;130:110405. doi: 10.1016/j.biopha.2020.110405. Epub 2020 Jul 14. PMID: 32679461
[12] Lê Ngọc Hùng. BCTK đề tài “Nghiên cứu mô hình phát triển trồng cây dược liệu Huệ đá lá nhỏ (Peliosanthes micrantha) tạo sảnphẩm bảo vệ sức khỏe tại huyện Krông Nô, tỉnh Đắk Nông”. Để tài hợp tác giữa KHCN Viện HL KHCN VN (hợp đồng số 144/HĐ-VHL) và UBND tỉnh Đắk Nông (hợp đồng số 41/HĐ-SKHCN), 2022 – 2024